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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Isolamento di monociti umani e differenziazione in macrofagi
- Ottenere sangue anticoagulato da individui sani anonimizzati presso una banca del sangue regionale e isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) come indicato di seguito.
nota: Eseguire tutte le fasi in una cappa a flusso laminare per colture tissutali. Utilizzare solo provette sterili e indossare guanti. Aggiungere il 10% di candeggina a tutti i prodotti correlati al sangue durante lo smaltimento. La soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) (1x) o la soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) (senza Ca2+ e Mg2+) possono essere utilizzate in modo intercambiabile.
- Preparare il tampone di diluizione: Integrare 1x PBS sterile con il 2% di siero fetale bovino (FBS) e 0,5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
- Preparare il terreno di coltura: Integrare il terreno RPMI-1640 con FBS (10% (v/v)), glutamax (2 mM) e Penicillina/Streptomicina (50 U.I./50 μg/mL)
- Preraffreddare il buffer di scorrimento (Tabella dei materiali) secondo il protocollo del produttore.
- Diluire il sangue intero con due volumi di tampone di diluizione. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire 15 mL di sangue anticoagulato in una provetta da 50 mL contenente 30 mL di tampone di diluizione. Mescolare delicatamente per inversione.
- Per ogni 10 mL di sangue intero o 30 mL di sangue diluito, aggiungere 15 mL del terreno del gradiente di densità a una provetta vuota da 50 mL.
- Stratificare il terreno del gradiente di densità del passaggio 1.1.5 con 30 mL di sangue diluito in modo lento e costante utilizzando una pipetta sierologica da 25 mL. Tenere la punta della pipetta contro la parete del tubo e il tubo con un angolo inclinato.
- Trasferire con cura le provette in una centrifuga a secchio oscillante. Evitare di disturbare le due fasi. Centrifugare le provette a 400 x g a temperatura ambiente (RT) per 25 minuti con accelerazione e decelerazione impostate al valore minimo.
- Rimuovere con cautela lo strato di plasma superiore (trasparente) utilizzando una pipetta da 10 ml e smaltirlo in un contenitore con candeggina (10%).
- Raccogliere lo strato interfasico (bianco) di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC, Figura 1) con una pipetta da 10 mL e trasferirlo in una provetta fresca da 50 mL. Combinare lo strato bianco di diverse provette dello stesso donatore in una provetta da 50 mL fino a 30 mL.
- Portare ciascuna provetta a un volume totale di 50 mL con il tampone di diluizione del passaggio 1.1.1 e centrifugare a 300 x g e 4 °C per 10 min. Rimuovere il surnatante con una pipetta da 10 mL e smaltirlo in un contenitore con candeggina (10%).
- Risospendere ogni pellet cellulare in 1 mL del tampone di corsa preraffreddato dal passaggio 1.1.3 utilizzando una micropipetta p1000. Combinare le sospensioni cellulari dello stesso donatore in una nuova provetta da 15 mL. Portare il volume di ciascuna provetta a 15 mL con il tampone di corsa pre-raffreddato e mescolare bene per inversione.
- Prelevare un'aliquota di 20 μl della sospensione cellulare del passaggio 1.1.11 e preparare una diluizione 1:100 utilizzando 1x PBS sterile. Determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
- Centrifugare la sospensione cellulare dal punto 1.1.11 a 300 x g e 4 °C per 10 minuti e rimuovere il surnatante con una pipetta da 10 mL. Se necessario, utilizzare una micropipetta p200 per rimuovere completamente il surnatante.
- Risospendere le PBMC isolate in 80 μl di tampone di funzionamento MACS pre-raffreddato per ogni cella 1 x 107, sommando fino a un massimo di 800 μl di tampone.
- Aggiungere 20 μL di microsfere CD14 anti-umane per ogni 1 x 107 cellule o fino a 100 μL per campione di sangue (~100 mL di sangue non diluito). Mescolare bene per inversione e porre su un rotatore di tubi per 20 minuti mescolando continuamente a 4 °C.
- Estrarre i campioni dal rotatore di provette, aggiungere 10 mL di tampone di corsa pre-raffreddato a ciascuna provetta e centrifugare a 300 x g (accelerazione = 5, decelerazione = 5) e 4 °C per 10 minuti.
- Rimuovere il surnatante con una pipetta da 10 mL e risospendere fino a 1 x 108 cellule in 500 μL di tampone di corsa pre-raffreddato (2 x 108/mL).
- Eseguire l'isolamento delle cellule CD14-positive mediante smistamento magnetico delle celle utilizzando un sistema manuale o automatizzato (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
- Prelevare un'aliquota di 20 μl della sospensione cellulare del passaggio 1.1.18 dopo la selezione CD14-positiva e preparare una diluizione 1:100 utilizzando 1x PBS sterile. Determinare il numero di cellule contando le cellule su un emocitometro.
- Centrifugare le cellule CD14-positive a 300 x g e RT per 10 minuti. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta da 10 ml o un sistema a vuoto.
- Risospendere il pellet cellulare dal passaggio 1.1.20 in un terreno di coltura preriscaldato dal passaggio 1.1.2 fino a una densità cellulare finale di 1 x 107 cellule/mL.
- Seminare i monociti CD14-positivi isolati a una densità cellulare di 5 x 106 cellule.
- Su una piastra di coltura tissutale da 10 cm, aggiungere 10 mL di terreno di coltura della fase 1.1.2 integrato con 50 ng/mL di fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF).
- Aggiungere 0,5 mL della sospensione cellulare del passaggio 1.1.21 al terreno di coltura goccia a goccia e agitare delicatamente la piastra. Incubare le cellule in un incubatore di coltura tissutale umidificato (37 °C, 5% CO2) per una notte.
- Il giorno successivo, aspirare il terreno utilizzando un sistema a vuoto per rimuovere le cellule che non si sono attaccate durante la notte. Aggiungere 10 mL di terreno di coltura fresco integrato con GM-CSF (50 ng/mL) e incubare le cellule in un incubatore di coltura tissutale umidificato (37 °C, 5% CO2) per 7 giorni per consentire la differenziazione completa (vedere la Figura 2A per la comparsa di monociti CD14+ a vari stadi di differenziazione in GM-CSF). Sostituire il terreno di coltura ogni 2-3 giorni e integrare ogni volta con GM-CSF fresco (50 ng/mL).
2. Preparazione dei componenti per l'elettroporazione
NOTA: Questo protocollo è progettato per una punta al neon da 10 μL (Tabella dei materiali). Per ogni trasfezione, utilizzare 1-2 x 105 celle. Si consiglia di seminare le cellule trasfettate su una piastra a 48 pozzetti o su una piastra a camera a 8 pozzetti (10 μL di cellule trasfettate per pozzetto). 1x DPBS sterile (senza Ca2+ e Mg2+) può essere utilizzato al posto del PBS.
- Il giorno 7, preparare un terreno privo di antibiotici integrando il terreno RPMI-1640 con FBS (10 % (v/v)) e glutamax (2 mM).
- Immergere il terreno RPMI-1640 senza siero, la soluzione di tripsina-EDTA (0,25%), 1 PBS sterile (senza Ca2+ e Mg2+) e il terreno di coltura completo della fase 1.1.2 in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Se si utilizzano piastre con fondo di vetro (per microscopia confocale), rivestire le piastre con bromidrato di poli-D-lisina.
- Rivestire una capsula a 8 pozzetti con 200 μL di bromidrato di poli-D-lisina (0,1 mg/mL in 1x PBS sterile) e incubare per 5 minuti a RT.
- Aspirare la soluzione di poli-D-lisina e lavare il vetro una volta con 1x PBS sterile. Aspirare il PBS e procedere con il passaggio 2.4.
- Aggiungere 200 μl di terreno privo di antibiotici per pozzetto della piastra a 48 pozzetti o della piastra a 8 pozzetti e pre-incubare in un incubatore di coltura tissutale umidificato (37 °C, 5% CO2) fino al momento di piastrare le cellule trasfettate.
3. Preparazione delle celle per l'elettroporazione
NOTA: La resa di MDM da una piastra di 10 cm alla fine del periodo di differenziazione di 7 giorni è di circa 1,5 x 106 cellule. 1x DPBS sterile (senza Ca2+ e Mg2+) può essere utilizzato al posto del PBS. Questo protocollo è stato ottimizzato in modo che la maggior parte dei macrofagi venga staccata dalla piastra con il mantenimento della vitalità e dell'integrità cellulare. L'MDM è difficile da staccare dalle piastre di coltura cellulare. Pertanto, potrebbe essere necessario eseguire due volte i passaggi 3.2 e 3.3 per dissociare le cellule. Assicurarsi che ogni tempo di incubazione con tripsina-EDTA (0,25%) non superi i 5 minuti.
- Aspirare il terreno da macrofagi completamente differenziati su piastre da 10 cm e lavare il monostrato cellulare con terreno caldo RPMI-1640 privo di siero. Assicurati di rimuovere completamente il mezzo.
- Raccogliere le cellule aggiungendo 2 mL di soluzione calda di tripsina-EDTA (0,25%) per piatto da 10 cm e incubare in un incubatore di coltura tissutale umidificato (37 °C, 5% CO2) per 5 minuti.
- Completare il distacco delle cellule pipettando delicatamente la soluzione di tripsina-EDTA (0,25%) su e giù su tutta l'area della piastra utilizzando una micropipetta p1000. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di terreno di coltura completo caldo dal punto 1.1.2.
- Portare la parabola su un microscopio a campo chiaro e verificare la presenza di distacco di cellule in vari campi visivi. Se c'è una quantità considerevole di cellule ancora attaccate, ripetere i passaggi 3.2-3.3.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 minuti a RT.
- Aspirare il terreno e risospendere le cellule in 10 mL di 1x PBS sterile preriscaldato a 37 °C. Prelevare un'aliquota da 20 μl per determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
- Prelevare 1-2 x 105 cellule per trasfezione prevista e metterle in una provetta da 15 mL. Portare a un volume finale di 15 mL con 1x PBS sterile preriscaldato. Centrifugare a 250 x g per 5 min a RT.
- Aspirare il PBS e centrifugare ancora una volta per 1 minuto a 250 x g. Rimuovere eventuali residui di PBS dal pellet cellulare utilizzando una micropipetta p200.
4. Nucleofececazione dei componenti della caspasi BiFC in macrofagi umani derivati da monociti
NOTA: Questa sezione del protocollo viene eseguita utilizzando il sistema di trasfezione Neon (Tabella dei materiali). Questo protocollo delinea i passaggi per trasfettare 1-2 x 105 cellule utilizzando una punta al neon da 10 μl (Tabella dei materiali). Se si utilizza una punta al neon da 100 μl, aumentare le dimensioni di conseguenza. Evitare di esporre le cellule al tampone di risospensione R per più di 15 minuti, poiché ciò potrebbe ridurre la vitalità cellulare e l'efficienza della trasfezione.
- Diluire il plasmide reporter (ad es. mCherry o dsRedmito a 100 ng/μL) in acqua priva di nucleasi o tampone TE 0,5x per visualizzare le cellule trasfettate.
- Diluire i plasmidi BiFC della caspasi a una concentrazione appropriata in acqua priva di nucleasi o tampone TE 0,5x, in modo che il volume totale dei plasmidi non superi il 30% del volume totale di trasfezione di 10 μL (cioè 300 ng/μL di C1 Pro-VC e 300 ng/μL di C1 Pro-VN).
- Preparare una microprovetta sterile da 1,5 mL per ogni trasfezione prevista e aggiungere la quantità appropriata di plasmide reporter (ad esempio, 50 ng o 0,5 μL) e plasmidi BiFC caspasi (ad esempio, 300 ng o 1 μL di C1 Pro-VC e 300 ng o 1 μL di frammento C1 Pro-VN). Tenere sempre i microtubi nel cofano.
- Posizionare la stazione di pipetta, il dispositivo, i puntali, i tubi di elettroporazione e la pipetta in una cappa a flusso laminare sterile.
nota: La stazione di pipetta, il dispositivo, i puntali, i tubi di elettroporazione e la pipetta sono inclusi nel sistema di trasfezione al neon.
- Collegare l'alta tensione e il connettore del sensore sulla stazione di pipettatura alle porte posteriori del dispositivo secondo le istruzioni del produttore. Tenere la stazione di pipettazione vicino al dispositivo.
- Collegare il cavo di alimentazione alla presa CA posteriore e procedere al collegamento del dispositivo alla presa elettrica. Premere l'interruttore di alimentazione per accendere il dispositivo.
- Inserire i parametri di trasfezione nella schermata di avvio visualizzata quando il dispositivo è acceso e collegato in modo appropriato. Premere su Tensione, immettere 1000 e premere su Done per impostare la tensione su 1000 V. Premere su Larghezza, immettere 40 e premere su Fine per impostare la durata dell'impulso su 40 ms. Infine, premere su # Impulsi, inserire 2 e premere su Fine per impostare il numero di impulsi elettrici su 2.
- Prendere una delle provette per elettroporazione (fornite nel kit) e riempirla con 3 mL di tampone elettrolitico E (per puntali da 10 μL e forniti nel kit) a RT. Inserire la provetta per elettroporazione nel portapipetta sulla stazione di pipetta. Assicurarsi che l'elettrodo sul lato del tubo sia rivolto verso l'interno e che si senta un clic quando il tubo viene inserito.
- Prendere il pellet di cella del passaggio 3.8 e aggiungere 10 μl di tampone R di risospensione preriscaldato (fornito nel kit) per ogni 1-2 x 105 cellule. Mescolare delicatamente con una micropipetta p20. Aggiungere 10 μl di sospensione cellulare a ciascuna provetta impostata al punto 4.3 e mescolare delicatamente con una micropipetta p20.
- Prendere la pipetta e inserire un puntale premendo il pulsante sul secondo arresto. Assicurarsi che il morsetto raccolga completamente lo stelo di montaggio del pistone nel puntale e che non si osservi alcuno spazio nella testa superiore della pipetta.
- Per aspirare il campione, premere il pulsante sulla pipetta fino al primo arresto e immergerlo nella prima provetta contenente la miscela di DNA cellula/plasmidico. Aspirare lentamente la miscela nel puntale della pipetta.
nota: Evitare le bolle d'aria in quanto possono causare archi elettrici durante l'elettroporazione e, se rilevate dal dispositivo, possono impedire l'erogazione dell'impulso elettrico. Se si osservano bolle d'aria, rilasciare il contenuto nel tubo e provare ad aspirare di nuovo.
- Inserire la pipetta con il campione con molta attenzione nel portapipetta. Assicurarsi che la pipetta scatti e che sia posizionata correttamente.
- Premere Start sul touchscreen e attendere che vengano erogati gli impulsi elettrici. Un messaggio sullo schermo indicherà il completamento.
- Rimuovere lentamente la pipetta dalla stazione e aggiungere immediatamente la sospensione cellulare trasfettata nel pozzetto corrispondente con un terreno privo di antibiotici preriscaldato dal passaggio 2.4 premendo lentamente il pulsante fino al primo arresto.
nota: Questa punta può essere riutilizzata fino a tre volte per lo stesso plasmide; in caso contrario, gettarlo in un contenitore per rifiuti a rischio biologico premendo il pulsante fino al secondo arresto.
- Ripetere i passaggi 4.10-4.14 per ogni provetta contenente una miscela di DNA cellulare/plasmidico.
- Agitare delicatamente la piastra con cellule trasfettate e incubare per 1-3 ore in un incubatore di coltura tissutale umidificato (37 °C, 5% CO2).
- Aggiungere a ciascun pozzetto 200 μl di terreno di coltura preriscaldato (terreno completo) dal passaggio 1.1.2. Posizionare nuovamente la piastra nell'incubatore per colture tissutali umidificato (37 °C, 5% CO2). Attendere almeno 24 ore per l'espressione genica.
- Il giorno successivo, ispezionare la vitalità cellulare e l'efficienza di trasfezione utilizzando un microscopio a epifluorescenza.
- Accendere il microscopio a epifluorescenza e la scatola della sorgente di luce fluorescente secondo le istruzioni del produttore e posizionare il piatto di coltura sul tavolino del microscopio.
- Selezionare l'obiettivo 10x o 20x e il filtro 568 nm (RFP).
- Per stimare la vitalità delle cellule, premere il pulsante LED a luce trasmessa (TL) per visualizzare tutte le celle nel campo selezionato. Mentre si guarda nell'oculare del microscopio, ruotare la manopola di messa a fuoco fino a quando non si osservano le cellule e verificare l'attacco delle cellule nel campo selezionato.
nota: Le celle completamente attaccate rappresentano le celle vitali mentre le celle flottanti rappresentano le cellule non vitali. Se la confluenza del pozzetto è elevata, la presenza di celle non attaccate potrebbe essere il risultato di una sovrastima del numero di cellule e non il risultato di una bassa vitalità. Tuttavia, una bassa confluenza accompagnata da un alto contenuto di cellule galleggianti indica una bassa vitalità che può derivare dall'insorgenza di archi elettrici durante l'elettroporazione, dalla tossicità plasmidica o dalla sovraesposizione al tampone R di risospensione. Non utilizzare pozzetti che mostrano quest'ultimo comportamento.
- Per stimare l'efficienza di trasfezione, concentrarsi sulle celle nel campo selezionato in condizioni di luce trasmessa come descritto sopra. Conta il numero totale di celle nel campo selezionato. Con il LED a luce trasmessa (TL) spento, premere il pulsante LED a luce riflessa (RL) per accenderlo.
- Concentrarsi sulla fluorescenza del gene reporter (globuli rossi) e contare il numero totale di cellule fluorescenti rosse. Ripetere questi passaggi (4.18.4-4.18.5) per almeno altri due campi per pozzetto.
5. Trattamento dell'acquisizione dati di MDM trasfettato e caspasi BiFC
NOTA: Se si prevede di visualizzare le cellule utilizzando un microscopio a epifluorescenza o confocale, si consiglia il trattamento con qVD-OPh (20 μM) per 1 ora prima del trattamento con lo stimolo scelto per prevenire la morte cellulare caspasi-dipendente (prevalentemente apoptosi). Questo viene utilizzato nell'imaging per evitare che le cellule si stacchino a causa dell'apoptosi, rendendole molto difficili da visualizzare mentre si spostano fuori dal piano focale. Si noti che il reclutamento delle caspasi nella piattaforma di attivazione e la BiFC della caspasi associata non dipende dall'attività catalitica della caspasi e, di conseguenza, l'inibizione della caspasi non influirà su questo passaggio.
- Trattare con lo stimolo scelto circa 24 ore dopo la trasfezione e incubare per tutto il tempo necessario per ciascun farmaco.
- Preparare il terreno di imaging integrando il terreno di coltura del passaggio 1.1.2 con Hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) e 2-mercaptoetanolo (55 μM).
- Aggiungere la concentrazione desiderata di stimolo al mezzo di imaging preriscaldato e mescolare delicatamente.
- Rimuovere con cura il terreno dalle cellule con una micropipetta p1000 e aggiungere 500 μl della soluzione di stimolo dal passaggio 5.1.2 lungo il lato del pozzetto.
- Per eseguire pozzetti di controllo non trattati, aggiungere un mezzo di imaging senza lo stimolo.
- Incubare le cellule in un incubatore di coltura tissutale umidificato (37 °C, 5% CO2) per il tempo indicato per ciascun trattamento.
- Visualizzare le cellule utilizzando un microscopio a epifluorescenza o confocale.
- Accendere il microscopio e la sorgente luminosa fluorescente, seguendo le istruzioni del produttore.
- Selezionare l'obiettivo 10x o 20x e posizionare il piatto di coltura sul tavolino del microscopio.
- Utilizzando l'oculare del microscopio, individuare le cellule sotto il filtro a 568 nm e mettere a fuoco le cellule che esprimono il reporter dsRedmito/mCherry (globuli rossi).
- Conta tutti i globuli rossi nel campo visivo e registra il numero.
- Mentre ci si trova nello stesso campo visivo, passare ai filtri 488 o 512 (GFP o YFP), procedere al conteggio del numero di globuli rossi che sono anche verdi (Venere positiva o BiFC-positiva) e registrare il numero.
- Contare almeno 100 cellule dsRedmito/mCherry -positive da un minimo di tre campi visivi individuali.
