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Visualizzazione dell'attivazione della caspasi nei macrofagi umani derivati da monociti

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonte: Bolívar, B. E., et. al., Visualizzazione della prossimità indotta dalle caspasi infiammatorie nei macrofagi umani derivati dai monociti. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video dimostra l'attivazione delle proteine caspasi nei macrofagi umani utilizzando proteine reporter di complementazione a fluorescenza bimolecolare. I pro-domini della caspasi-1 sono fusi con frammenti non fluorescenti di proteine di Venere, che vengono reclutati nei complessi dell'inflammasoma. La vicinanza degli inflammasomi induce il ripiegamento e la fluorescenza dei frammenti di Venere, confermando l'attivazione delle caspasi nei macrofagi.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Isolamento di monociti umani e differenziazione in macrofagi

  1. Ottenere sangue anticoagulato da individui sani anonimizzati presso una banca del sangue regionale e isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) come indicato di seguito.
    nota: Eseguire tutte le fasi in una cappa a flusso laminare per colture tissutali. Utilizzare solo p....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Figura 1: Panoramica schematica del flusso di lavoro sperimentale.

figure-results-2
Figura 2: Differenziazione dei monociti CD14 e trasfezione dell'MDM umano. (A) Immagini rappresentative in campo chiaro di monociti CD14+ provenient.......

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
per coltura tissutale a 48 pozzettiPiastre 2:34Genesee Scientifico25-108
Piastre per coltura tissutale da 10 cmVWRCodice 25382-166
2 Mercaptoetanolo 1000xThermo Fisher Scientifico21985023
Vetro di copertura a camera a 8 pozzetti con vetro di copertura da 1,5 HPCellvisc8-1.5H-N
Colonne AutoMACSMiltenyi (Biotec)Codice 130-021-101Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator
Separatore AutoMACS ProMiltenyi (Biotec)Codice 130-092-545Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator
Soluzione di lavaggio AutoMACS ProMiltenyi (Biotec)Codice 130-092-987Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator
Soluzione di risciacquo AutoMACSMiltenyi (Biotec)Codice 130-091-222Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator
Buffer in esecuzione di AutoMacMiltenyi (Biotec)130-091-221Per la separazione manuale o automatizzata con QuadroMACS o AutoMACS pro Separator
Microscopio invertito motorizzato Axio Observer Z1 dotato di unità disco rotante CSU-X1A 5000ZeissÈ possibile utilizzare qualsiasi microscopio confocale dotato di un modulo laser dotato di linee laser di lunghezze d'onda di 568 nm (RFP) e 488 o 512 nm (GFP o YFP)
AxioObserver A1, microscopio invertito per la ricercaZeissÈ possibile utilizzare qualsiasi microscopio a epifluorescenza con filtri a fluorescenza in grado di eccitare lunghezze d'onda di 568 nm (RFP) e 488 o 512 nm (GFP o YFP)
MICROSFERE CD14+Miltenyi (Biotec)Codice 130-050-201Per la separazione manuale o automatizzata con QuadroMACS o AutoMACS pro Separator
DPBS senza cloruro di calcio e cloruro di magnesiosigmaD8537-6x500ML
Plasmide mito rosso DsRedClontech632421Plasmidi simili che possono essere utilizzati come reporter fluorescenti possono essere trovati su Addgene
Siero fetale bovinoThermo Fisher Scientifico10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mLsigmaGE17-1440-02
Integratore GlutaMAX (100x)Thermo Fisher Scientifico35050079
GM-CSFThermo Fisher ScientificoPHC2011
Hemin BioXtra, da suino, INSERTO CHARACTR96,0% (HPLC)sigmaCodice: 51280-1G
HEPESThermo Fisher Scientifico15630106
Caspasi infiammatoria Plasmidi BiFCDisponibile su richiesta presso LBH lab
LPS-EB UltrapuroInvivogenTLRL-3PELPS
Colonne LSMiltenyi (Biotec)Codice 130-042-401Per la separazione manuale utilizzando solo il separatore QuadroMACS
Rack per provette MACS da 15 mLMiltenyi (Biotec)Codice 130-091-052Per la separazione manuale utilizzando solo il separatore QuadroMACS
MACS MultiStandMiltenyi (Biotec)Codice 130-042-303Per la separazione manuale utilizzando solo il separatore QuadroMACS
Plasmide di mCherryLaboratorio Yungpeng WangPlasmidi simili che possono essere utilizzati come reporter fluorescenti possono essere trovati su Addgene
Sistema di trasfezione al neonThermo Fisher ScientificoMPK5000Include dispositivo di elettroporazione al neon, pipetta e stazione di pipettaggio
Kit sistema di trasfezione al neon da 10 μlThermo Fisher ScientificoMPK1096Include il tampone di risospensione R, il tampone di risospensione T, il tampone elettrolitico E, 96 punte al neon da 10 μl e provette per elettroporazione al neon
Sale sodico di nigericina, soluzione prontasigmaSML1779-1ML
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientifico15140122
Bromidrato di poli-D-lisinasigmaP7280-5 mg
Separatore QuadroMACSMiltenyi (Biotec)Codice 130-090-976Per la separazione manuale utilizzando solo il separatore QuadroMACS
qVD-OPhPescatore (ApexBio)50-101-3172
RPMI 1640 MedioThermo Fisher Scientifico11875119
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenoloThermo Fisher Scientifico25200072
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientifico15575020

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Caspase ActivationHuman MacrophagesBimolecular Fluorescence ComplementationInflammasome ComplexEpifluorescence MicroscopyLipopolysaccharide TreatmentNigericin StimulusVenus Protein ReporterCaspase 1 Pro domainTransfection Protocol

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