Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dell'esperimento
- Fabbricazione del dispositivo per la coltura di organi intestinali (3 giorni)
- Utilizzando una stampante 3D, stampa gli stampi in plastica riutilizzabili per il dispositivo di coltura dell'organo (il dispositivo ha 6 pozzetti, con 24 fori piccoli e grandi, e per il coperchio del dispositivo).
NOTA: Questi stampi in plastica possono essere utilizzati per la fabbricazione di numerosi dispositivi.
- Inserire gli aghi con estremità smussata (22 G e 18 G) nella posizione appropriata all'interno dello stampo del dispositivo e fondere circa 20 g di miscela di polidimetilsilossano (PDMS) (rapporto in peso 1:10, base e catalizzatore) per un set di dispositivo e coperchio.
- Posizionare gli stampi in una camera a vuoto per 30 min, per rimuovere le bolle d'aria dalla miscela PDMS.
- Incubare gli stampi a 55 °C per una notte, per completare la polimerizzazione PDMS.
- Quando il PDMS è impostato, estrarre gli aghi dallo stampo e rilasciare con cautela il dispositivo di coltura e il coperchio dagli stampi di plastica.
- Rimuovere i residui di PDMS dal contorno del pozzetto utilizzando una lama chirurgica. Fissare il dispositivo PDMS e il coperchio del dispositivo su un vetro di copertura (micro vetrini da 75 mm x 50 mm) utilizzando un adesivo siliconico atossico e lasciare riposare le parti per una notte (applicare la colla sul lato liscio del dispositivo).
- Inserire dodici aghi da 22 G per il lume e dodici aghi da 18 G per il pozzetto. Fissa tutti gli aghi in posizione usando il silicone e lascialo riposare per una notte. Inserire due aghi da 18 G nel coperchio per un corretto flusso d'aria dentro e fuori dal dispositivo di coltura di organi intestinali.
- Controllare che tutti gli aghi non presentino perdite utilizzando una siringa piena d'acqua. Verificare che non vi siano perdite dai pozzetti riempiendo i pozzetti con acqua.
- Posizionare due nodi chirurgici su ogni ago da 22 G che verrà collegato al colon. Posizionare il dispositivo e il coperchio in un sacchetto di carta per autoclave e sterilizzare in autoclave.
- Terreno di coltura (0,5 h)
- In una cappa biologica, mescolare quanto segue (in una provetta da 50 mL): 37 mL di Dulbecco's Medium modificato (IMDM) di Iscove, 10 mL di siero sostitutivo KSR, 1 mL di integratore di B27, 0,5 mL di integratore N2, 0,5 mL di tampone HEPES 1 M e 0,5 mL di aminoacidi non essenziali.
- Filtrare e conservare l'intero mezzo a 4 °C.
- Preparazione di tubi e strumenti chirurgici
- Tagliare la lunghezza appropriata dei tubi per il lume di ingresso, il pozzetto di ingresso, il lume di uscita e il pozzetto di uscita (12 tubi corti e 12 tubi lunghi). Collegare un adattatore appropriato a ciascun lato del tubo.
- Prepara gli strumenti chirurgici: forbici dritte, 4 pinze sottili e 2 pinze affilate.
- Posizionare le provette e gli strumenti chirurgici in un sacchetto di carta per autoclave e sterilizzarli utilizzando un'autoclave.
- Preparare l'input luminale (stimolazione desiderata - batteri, feci, farmaci, ecc.).
- Prima dell'esperimento, determinare la carica batterica della coltura batterica, mediante diluizioni seriali, e la coltura in condizioni aerobiche e/o anaerobiche.
- Dopo aver calcolato la carica batterica, diluire le colture batteriche in un terreno di coltura tissutale sterile per ottenere la concentrazione batterica richiesta. Per i campioni fecali, filtrare con un colino da 100 μm.
nota: Per la stimolazione non batterica (farmaci, metaboliti, ecc.), diluire la sostanza alla concentrazione richiesta utilizzando il terreno di coltura intestinale.
2. Preparazione della configurazione dell'esperimento
- All'interno dell'incubatore per colture organistiche, accendere l'unità di riscaldamento e impostarla a 37 °C.
- Impostare le pompe e le siringhe di ingresso e uscita.
- Terreno di coltura tissutale in ingresso
- In una cappa biologica o a flusso laminare, riempire le siringhe del pozzetto di ingresso con un terreno di coltura completo. Il volume finale dipende dalla durata dell'esperimento e dalla velocità di flusso; di solito 1 mL/h più un terreno aggiuntivo per lo spurgo.
- Collegare i tubi alle siringhe utilizzando l'adattatore Luer-lock. Posizionare le siringhe riempite nelle pompe a siringa.
- Spurgare le siringhe di ingresso. Assicurarsi che il mezzo del pozzetto fuoriesca da tutti i tubi in un bicchiere di scarto.
- Ingresso luminale
- Riempire le siringhe luminali di input con il trattamento di stimolazione (batteri, farmaci, ecc.). Il volume dipende dalla durata dell'esperimento e dalla velocità di flusso (di solito 30 μL/h più un mezzo aggiuntivo per lo spurgo).
- Collegare i tubi alle siringhe utilizzando l'adattatore Luer-lock. Posizionare le siringhe riempite nelle pompe a siringa.
- Spurgare le siringhe di ingresso. Assicurarsi che la stimolazione fuoriesca da tutti i tubi in un bicchiere di scarto. Fare attenzione a non contaminare le diverse stimolazioni.
- Uscite
- Posizionare le siringhe vuote nelle pompe a siringa di uscita (impostare la modalità pompa su "prelievo").
- Configurazione del dispositivo
- Impostare il regolatore che controlla la portata della miscela di gas (95% O2 + 5% CO2) per un flusso delicato e minimo.
- Esaminare il dispositivo in una cappa laminare.
- Sciacquare gli aghi del dispositivo con IMDM sterile per lavare gli aghi.
- Aggiungere 500 μl di terreno di coltura sterile in ciascun pozzetto del dispositivo.
- Preparazione per la dissezione tissutale
- Inserire gli strumenti chirurgici sterili all'interno della cappa laminare.
- Riempire una siringa da 10 ml con IMDM sterile e collegare un ago smussato sterile (autoclavato) da 22 G per il lavaggio del colon.
3. Colture di organi
- Sacrificio dei topi e dissezione tissutale
- In un cappuccio laminare, sacrifica topi di età compresa tra 12 e 14 giorni mediante decapitazione. Spruzza i topi con etanolo al 70% e posiziona i topi su un piatto di plastica.
- Usando forbici affilate e pinze, seziona il topo ed estrai il tratto digestivo dallo stomaco all'ano tagliando tutto il grasso e i tessuti connettivi. Tagliate i due punti e metteteli su un nuovo piatto.
nota: Ridurre al minimo il contatto con il tessuto del colon. Non toccare la parte centrale del tessuto del colon. Tenere il fazzoletto delicatamente e solo ai bordi del fazzoletto.
- Sciacquare e lavare i due punti
- Al microscopio da dissezione, sciacquare delicatamente il contenuto del colon con IMDM sterile (nel lato prossimale) con la siringa da 10 ml preparata (passaggio 2.7.2). Dopo aver rimosso le feci dal tessuto intestinale, posizionare il colon in una nuova piastra a 6 pozzetti riempita con 0,5 ml di IMDM sterile.
- Collegamento dei due punti al dispositivo
- Prendi il fazzoletto, collegalo con cura all'ago da 22 G e fai una lega stretta con i due fili. A questo punto, è imperativo mantenere il corretto orientamento del colon rispetto al flusso del lume (prossimale = input, distale = output). Ripetere i passaggi 3.2-3.3 per tutti e 6 i fazzoletti.
- Verificare che i luer lock dell'ago di ingresso siano vuoti dal fluido. In caso contrario, svuotali. Aggiungere stimolazioni all'ago di ingresso Luer lock (per evitare l'ingresso di bolle d'aria nel lume). Ripeti questo passaggio per ogni colon con la stimolazione appropriata.
- Verificare che tutti i fazzoletti siano collegati e posizionare il coperchio sopra il dispositivo.
- Collegamento del dispositivo per coltura di organi alle pompe
- Posizionare il dispositivo nella camera preriscaldata a temperatura controllata (37 °C).
- Collegare il flusso di gas
- Collegare l'adattatore del gas al coperchio utilizzando l'apposito ago di ingresso.
- Collegare i tubi di ingresso e di uscita al dispositivo.
nota: Collegare il lato del colon prossimale alle vaschette di ingresso.
- Spurgare il lume con gli input di stimolazione.
- Far fluire delicatamente la stimolazione luminale attraverso l'intestino e verificare il flusso medio nei tubi di uscita.
- Lavare il mezzo esterno.
- Lavare il fluido esterno 3 volte (impostare le pompe a una velocità di 600 μL/min sia per il pozzo di ingresso che per quello di uscita). Ogni lavaggio dura 1 minuto (iniziando con lo svuotamento del pozzo).
- Inizia l'esperimento.
- Avviare le pompe alle seguenti velocità:
Portata: lumen: ingresso- 30 μL/h, uscita- 35 μL/h
Fluido esterno: ingresso: 1000 μL/h, uscita: 950 μL/h
nota: Il tempo dell'esperimento può variare da 30 minuti a 24 ore.
- Fine dell'esperimento (fino a 24 ore per colture di organi del colon)
- Scollegare tutti i tubi dal dispositivo.
- Scollegare i fazzoletti dagli aghi e continuare con le letture desiderate.
