Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Preparazione WS-CM
- Generare un mezzo intero condizionato con fumo (WS-CM) come descritto in precedenza.
- Preparare la WS-CM facendo passare il fumo di quattro sigarette di riferimento 3R4F attraverso il terreno 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) senza rosso fenolo utilizzando il seguente regime di fumo: 35-60-2, volume di boccata in ml, intervallo di boccata in sec e durata della boccata in sec, rispettivamente. Ogni preparazione genera un campione da 20 ml.
- Etichettare i tubi con la data, l'ora di completamento e il nome e il numero della sigaretta. Conservare le aliquote da 500 μl a -80 °C subito dopo aver completato l'affumicatura.
- Analizza le aliquote di WS-CM congelato per determinare i livelli di nicotina, nitrosammine specifiche del tabacco e idrocarburi policiclici aromatici come descritto in precedenza.
2. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico, PBMC
- Raccogliere sangue fresco da donatori sani (che non sono consumatori di prodotti del tabacco) Isolare le PBMC dal sangue fresco come descritto di seguito.
- Prima dell'arrivo della sacca di sangue, tenere a portata di mano un flacone da 500 ml, le forbici, il tampone di isolamento e la soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) (RT) di Dulbecco in una cappa per colture cellulari di livello 2 (BSL-2). Il tampone di isolamento deve essere protetto dalla luce.
- Tenere la sacca di sangue capovolta e tagliare il tubo appena sotto il punto in cui è stato bloccato, lasciando almeno 3 cm di tubo.
- Rimuovere il tappo dal flacone da 500 ml e tenere il tubo sopra l'apertura del flacone. Raccogli la sacca di sangue e capovolgila per consentire al sangue di fluire liberamente dalla sacca nella bottiglia fino a quando la sacca non è vuota. Lascia che il sangue scorra sulla parete interna della bottiglia anziché verso il basso per evitare di creare bolle.
- Versare il tampone isolante nel flacone con un rapporto di 1:5 tra il tampone isolante e il sangue. Tappare bene la bottiglia e capovolgerla delicatamente, da un capo all'altro, 10 volte. Lasciare il flacone nella cappa di coltura cellulare per incubare a luci spente, per 1 ora a RT.
- Uno strato chiaro di colore paglierino si accumulerà sopra il sangue. Rimuovere questo strato utilizzando una pipetta sierologica da 25 ml in provette coniche da 50 ml. La quantità raccolta può variare da 50 a 300 ml, a seconda del soggetto che ha donato il sangue.
- Centrifugare le provette a 200 x g per 10 minuti a RT.
- Aspirare il surnatante traslucido, lasciando la pallina color sangue scuro. Il pellet sarà sciolto ma viscoso.
- Pipettare 3 ml di tampone isolante in provette coniche da 15 ml.
- Al pellet risospeso, aggiungere 20 ml di DPBS ogni 50 ml di liquido paglierino raccolto al punto 2.1.5. Vortice per miscelare accuratamente e consolidare il liquido risospeso da più tubi. Questo liquido contiene cellule del sangue in sospensione.
- Con una pipetta di trasferimento, trasferire 5 ml di cellule ematiche sospese su 3 ml di tampone di isolamento al punto 2.1.8. Inclinare lentamente e delicatamente il tubo conico da 15 ml che contiene la sospensione cellulare per creare due strati separati. Centrifugare le provette a 400 x g per 40 minuti a RT con un'accelerazione minima e senza freni.
- Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere lo strato intermedio torbido risultante (buffy coat) contenente PBMC in una provetta conica da 50 ml. Evita di disegnare altri livelli chiari sotto di esso. Trasferire non più di 25 ml in ogni provetta conica da 50 ml.
- Aggiungere 25 ml di tampone di corsa a freddo (o più per riempire l'intero volume rimanente del tubo conico da 50 ml) per lavare le cellule. Centrifugare le celle a 400 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Risospendere il pellet con 10 ml di tampone di corsa. Questo contiene PBMC. Conta le cellule e usale immediatamente o mettile sul ghiaccio per il congelamento.
3. Congelare e scongelare le PBMC
- Centrifugare le cellule mononucleate del sangue eriferico (PBMC) raccolte nella fase 2.1.13 per 10 minuti a 400 x g.
- Riempire il contenitore di congelamento con alcol isopropilico secondo le istruzioni del produttore.
cautela: L'alcol isopropilico è infiammabile e acutamente tossico.
- Risospendere il pellet con il terreno RPMI 1640 (4 °C) contenente il 20% di siero fetale bovino (FBS) e il 10% di dimetilsolfossido (DMSO). Questo è il mezzo di congelamento RPMI 1640. Risospendere il pellet con una quantità di mezzo di congelamento che si tradurrà in una sospensione avente circa 5 x 107 cellule/ml. Il numero di celle disponibili per il congelamento varia.
- Erogare 1 ml di aliquote di sospensione cellulare in provette da 2 ml e posizionare le provette nel contenitore di congelamento. Posizionare il contenitore di congelamento con le crioprovette in un congelatore a -80 °C per conservare l'O/N, quindi rimuovere le crioprovette e trasferirle per conservarle in un congelatore criogenico tra -150 °C e -190 °C.
- Rimuovere il criotubo dalla conservazione criogenica e scongelarlo rapidamente agitando delicatamente in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Trasferire immediatamente le PBMC scongelate nella crioprovetta in una provetta conica da 15 ml con 10 ml di terreno completo RPMI 1640 (4 °C) contenente il 10% di FBS, l'1% di Pen/Strep e l'1% di L-glutammina. Il contenuto del criotubo scongelato deve essere trasferito il prima possibile per ottenere la massima vitalità cellulare.
- Centrifugare i PBMC a 400 x g per 10 min.
- Risospendere il pellet con 5 ml di terreno completo RPMI 1640 e contare le cellule.
- Misurare la vitalità cellulare con metodi consolidati come il metodo di esclusione del blu di tripano. Generalmente, la vitalità cellulare con questo metodo è di circa il 90-95%. Le PBMC sono ora pronte per l'uso negli esperimenti.
4. Colorazione intracellulare e citometria a flusso
NOTA: Le diluizioni elencate qui sono per lo scopo di questo studio. Le diluizioni possono essere regolate di conseguenza.
- Diluire il WS-CM in una piastra a 96 pozzetti utilizzando il terreno completo RPMI fino a un volume totale di 100 μl/pozzetto alla concentrazione di 0,3, 1,56, 3 e 5 μg/ml di unità equi-nicotina.
- Nella stessa piastra, diluire la nicotina alle seguenti concentrazioni: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 e 4000 μg/ml.
cautela: La nicotina è estremamente tossica e pericolosa per l'ambiente.
- Aggiungere 100 μl di PBMC sospese in terreno completo RPMI a una concentrazione di 1 × 106 cellule/pozzetto. Il volume totale delle cellule più WS-CM o nicotina sarà di 200 μl/pozzetto.
- Coprire la piastra e incubare per 3 ore a 37 °C e 5% di CO2.
- Lavare le celle a RT centrifugando a 300 × g per 3 minuti, aspirando il surnatante, agitando il fondo della piastra con la piastra coperta e infine risospendendo le celle con 200 μl di tampone di funzionamento ghiacciato e ripetere la fase di lavaggio ancora una volta.
- Aggiungere 200 μl di terreno completo RPMI alla piastra e ripetere la fase di lavaggio ancora una volta.
- Preparare le concentrazioni di lavoro di 2 μl/ml di GolgiPlug e 10 μg/ml di LPS utilizzando il terreno completo RPMI e aggiungere 200 μl a ciascun pozzetto.
- Incubare la piastra per 6 ore a 37 °C e 5% di CO2.
- Al termine del passaggio 9.8, lavare le celle con tampone di scorrimento (4 °C) e centrifugare a 300 x g per 3 minuti a 4 °C.
- Aggiungere 100 μl di Cytofix a ciascun pozzetto e incubare per 20 minuti a 4 °C.
- Lavare le celle 3 volte come descritto al punto 9.9 con 1x Permwash (4 °C) a 300 x g per 3 minuti a 4 °C.
- Aggiungere 45 μl di 1x Cytoperm a ciascun pozzetto seguiti da 5 μl di ciascuno dei seguenti anticorpi a ciascun pozzetto: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incubare a 4 °C per 30 min.
- Lavare le celle due volte come descritto al punto 9.9 con 1 permwash (4 °C) e una volta con tampone di scorrimento (4 °C) a 300 x g per 3 minuti a 4 °C.
- Risospendere le cellule con 200 μl di paraformaldeide al 2% (4 °C). Trasferire le cellule in provette da 12 × 75 mm e analizzare i campioni su un citometro a flusso.
cautela: La paraformaldeide è corrosiva, tossica acuta e pericolosa per la salute.
