Sintesi di biofilm in vitro da parte di Staphylococcus aureus

1. Preparazione del biofilm in vitro

1. Ottenere colonie isolate di S. aureus da un ceppo crioconservato utilizzando una tecnica a striature su una piastra di agar ricca di sostanze nutritive, come l'agar di soia triptico (vedi Tabella dei materiali).
2. Rivestire i singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con 100 μL di poli-L-lisina (PLL) allo 0,001% (v/v) diluita in H₂O sterile e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Aspirare asetticamente la soluzione PLL utilizzando una trappola per aspirazione assistita dal vuoto. Lasciare asciugare i pozzetti per una notte a temperatura ambiente.
   nota: Tutte le fasi di aspirazione del protocollo vengono eseguite utilizzando una trappola di aspirazione assistita dal vuoto, se non diversamente specificato.
3. Preparare una coltura notturna inoculando una colonia di S. aureus in terreno alfa essenziale minimo (MEMα) integrato con glucosio al 2% e incubare a 37 °C, agitando a 200 giri/min per 16-18 ore.
4. Diluire la coltura durante la notte trasferendo da 50 μL a 5 mL di MEMα fresco integrato con glucosio al 2% e incubare a 37 °C, agitando a 200 giri/min, fino alla metà della fase logaritmica, generalmente compresa tra una densità ottica di 600 (OD_{600 nm}) di 0,5-0,8. Utilizzare MEMα per normalizzare la coltura medio-logaritmica a un diametro esterno di_{600 nm} di 0,1.
5. Trasferire 150 μl di coltura normalizzata in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti trattata con PLL. Incubare staticamente per 18-20 ore in camera umidificata a 37 °C.
   nota: I biofilm possono essere coltivati anche in altri formati, come i vetrini a μ canali (vedi Tabella dei materiali).
6. Aspirare il surnatante per rimuovere le cellule planctoniche. Lavare delicatamente la biomassa rimanente con 150 μl di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) per rimuovere le cellule non attaccate. Aggiungere HBSS in modo graduale per evitare di interrompere il biofilm.
   nota: Durante l'aspirazione del surnatante e dell'HBSS durante i lavaggi, lasciare una quantità sufficiente di liquido (surnatante o HBSS) nei pozzetti contenenti il biofilm in modo che il biofilm sia ancora immerso. Ciò impedisce l'interruzione della struttura del biofilm quando l'HBSS viene aggiunto goccia a goccia per lavare il biofilm.
7. Ripetere il passaggio 1.6 almeno altre due volte per rimuovere tutte le cellule planctoniche. A questo punto, i biofilm sono pronti per gli esperimenti a valle immediati.
   nota: Se i biofilm non vengono utilizzati per esperimenti sui neutrofili, l'HBSS può essere sostituito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). L'HBSS è preferito al PBS poiché l'HBSS contiene componenti, incluso il glucosio, che forniscono le condizioni ottimali per l'attivazione dei neutrofili.