1. Preparazione antigenica
NOTA: Tre diversi preparati antigenici possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria all'Hi. Si tratta di: 1) un componente subcellulare (tipicamente proveniente dalla parete cellulare batterica); 2) batteri uccisi e inattivati; e 3) batteri vivi. Determinare l'uso di ciascun preparato antigenico prima dell'inizio di qualsiasi esperimento.
- Componenti subcellulari
- Ottenere componenti subcellulari da fonti, inclusi preparati commerciali, componenti sviluppati internamente e/o da altri ricercatori.
nota: Possono essere utilizzati componenti subcellulari, solitamente provenienti dalla parete cellulare batterica, che includono proteine della membrana esterna come P6 e lipooligosaccaride (LOS). Questi componenti subcellulari sono solitamente derivati in centri specializzati. La descrizione di come sono fatti va oltre lo scopo di questo articolo. Si consiglia il contatto diretto con esperti del settore per ottenere questi componenti.
- Batteri uccisi/inattivati
- Ottenere i batteri dal campione appropriato (ad es. espettorato o broncoscopia). Confermare il ceppo come H. influenzae utilizzando un laboratorio di microbiologia appropriato. Eseguire la tipizzazione dei campioni di H. influenzae per confermare che non sono tipizzabili (NTHi, da un laboratorio specializzato in microbiologia).
- Per ottenere un antigene rappresentativo, utilizzare più ceppi di NTHi (almeno 5, ciascuno di circa la stessa quantità) per creare un antigene aggregato. Conservare i ceppi a -70 °C in brodo di glicerolo in provette da microcentrifuga.
nota: In questo esperimento, sono stati utilizzati dieci ceppi distinti.
- Scongelare i ceppi (una provetta da microcentrifuga alla volta) su piastre di agar al cioccolato e far crescere per una notte in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2. Aggiungere i batteri a 500 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e lavarli due volte (centrifugare a 300 x g per 5 minuti). Utilizzare uno standard MacFarland o uno spettrofotometro per aliquotare NTHi a una concentrazione di 10-8 mL (utilizzando un contenitore da 5 mL o equivalente).
- Inattivare i batteri con il calore mettendoli a bagnomaria a una temperatura di 56 °C per 10 minuti.
- Sonicare i batteri utilizzando un'impostazione di sonicazione continua a una velocità medio-bassa per 30 secondi.
- Aliquotare il volume appropriato di campioni in provette per microcentrifuga. Per un campione di10-8 mL, utilizzare aliquote da 50 μL (cioè 20 campioni per mL) e congelarle a -70 °C fino al momento del bisogno.
- Batteri vivi
- Innanzitutto, caratterizzare i batteri vivi come indicato nel passaggio 1.2.1. Usa una varietà ben caratterizzata. Assicurarsi che il ceppo sia conservato anche in brodo di glicerolo a -70 °C come riserva.
- Far crescere i batteri su terreni arricchiti come piastre di agar al cioccolato o in brodo.
- Per utilizzare le piastre di agar di cioccolato, diffondere i batteri per un minimo di ogni 3-4 giorni con spatole sterili.
- In alternativa, utilizzare il brodo Brain Heart Infusion (BHI) arricchito con i fattori X (emina) e V (β-nicotinammide adenina dinucleotide) per far crescere i batteri. Inoculare NTHi da piastre notturne in 5-10 ml di brodo BHI integrato con emina e β-nicotinamide adenina dinucleotide (entrambi 10 μg/mL) e coltura notturna a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2.
nota: Ciò ha il vantaggio della riproducibilità, di un numero maggiore di unità formanti colonie (CFU) e di tutti i batteri che si trovano in una fase simile di crescita logaritmica (su piastre, la vitalità batterica può essere maggiore a seconda della posizione nella coltura).
- Utilizzare una molteplicità di infezioni (MOI) di 100 batteri in una cellula per suscitare una forte risposta immunitaria mantenendo la vitalità cellulare. Utilizzare lo standard MacFarland o lo spettrofotometro per valutare il numero di batteri.
- Assicurarsi che il terreno utilizzato per i saggi NTHi vivi sia privo di siero umano, in quanto ciò ucciderà i batteri. I campioni di siero animale (ad esempio, siero fetale di vitello) generalmente non causano alcun problema.
nota: Utilizzare i metodi descritti di seguito per analizzare campioni di tessuto standard come sangue periferico, campioni di broncoscopia (in particolare lavaggio broncoalveolare (BAL)) e tessuto polmonare resecato. Incubare i campioni con l'antigene Hi da 10 minuti a 24 ore o più.
2. Valutazione della funzione dei linfociti nel sangue periferico
- Utilizzare sangue intero o preparati di cellule mononucleate per i saggi di citometria a flusso.
- Acquisire campioni da ogni soggetto mediante venipuntura. Raccogliere 4 mL di sangue da una vena periferica in una provetta di litio-eparina e dividere i campioni in aliquote per il controllo e la stimolazione dell'antigene.
- Aggiungere anticorpi costimolatori (anti-CD28 e CD49d, 1 μL/mL) a entrambi i campioni. Aggiungere NTHi al campione di antigene e incubare a 37 °C e 5% di CO2 per 1 ora. Per la preparazione di NTHi uccisa, aggiungere 200 μL di antigene a 2 mL di sangue. Per l'NTHi vivo, aggiungere ai globuli bianchi cellule NTHi vive con un MOI di 100:1 (misurato dall'emocitometro).
- Aggiungere l'agente bloccante del Golgi Brefeldin A (10 μL/mL) ai campioni e incubarli per altre 5 h.
nota: Il blocco dell'apparato di Golgi impedisce alle citochine di essere esportate al di fuori della cellula.
- Se si utilizza sangue intero, lisare gli eritrociti con cloruro di ammonio allo 0,8% per lasciare solo i leucociti in soluzione. Fissare i leucociti utilizzando 500 μl di paraformaldeide all'1%-2% per 1 ora.
- Contare le cellule con l'emocitometro, permeabilizzare10-6 cellule con 100 μl di saponina allo 0,1% per 15 minuti e incubare le cellule con anticorpi marcati con fluorescenza. Lavare le cellule e analizzarle con un citometro a flusso.
nota: La quantità di anticorpi marcati con fluorescenza sarà specifica per ciascuna citochina. Seguire le istruzioni del produttore. Tipicamente,10-6 cellule in 100 μL di soluzione vengono colorate per 1 ora. La maggior parte degli anticorpi ottenuti in commercio sarà sufficiente per eseguire 25-100 test.
- Determinare la proporzione di cellule che rispondono all'antigene controllando la popolazione linfocitaria pertinente (le cellule sono controllate da CD45, poi da CD3 e successivamente dall'espressione di CD4 o CD8) come mostrato nella Figura 1. Eseguire la colorazione di fondo su cellule non stimolate per tutte le citochine da analizzare. Screening di 100.000 cellule per analizzare ciascuna citochina sia per le cellule stimolate che per il controllo.
