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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Preparazione antigenica
- Batteri vivi
- Innanzitutto, caratterizzare i batteri vivi. Ottenere i batteri dal campione appropriato (ad es. espettorato o broncoscopia). Confermare il ceppo come Haemophilus influenzae utilizzando un laboratorio di microbiologia appropriato. Eseguire la tipizzazione dei campioni di H. influenzae per confermare che non sono tipizzabili (da un laboratorio specializzato in microbiologia). Usa una varietà ben caratterizzata. Assicurarsi che il ceppo sia conservato anche in brodo di glicerolo a -70 °C come riserva.
- Far crescere i batteri su terreni arricchiti come piastre di agar al cioccolato o in brodo.
- Per utilizzare le piastre di agar di cioccolato, diffondere i batteri per un minimo di ogni 3-4 giorni con spatole sterili.
- In alternativa, utilizzare il brodo Brain Heart Infusion (BHI) arricchito con i fattori X (emina) e V (β-nicotinammide adenina dinucleotide) per far crescere i batteri. Inoculare H. influenzae (NTHi) non tipizzabile da piastre notturne in 5-10 mL di brodo BHI integrato con emina e β-nicotinamide adenina dinucleotide (entrambi 10 μg/mL) e coltura notturna a 37 °C in un incubatore al 5% di anidride carbonica, CO2.
nota: Ciò ha il vantaggio della riproducibilità, di un numero maggiore di unità formanti colonie (CFU) e di tutti i batteri che si trovano in una fase simile di crescita logaritmica (su piastre, la vitalità batterica può essere maggiore a seconda della posizione nella coltura).
- Utilizzare una molteplicità di infezioni (MOI) di 100 batteri in una cellula per suscitare una forte risposta immunitaria mantenendo la vitalità cellulare. Utilizzare lo standard MacFarland o lo spettrofotometro per valutare il numero di batteri.
- Assicurarsi che il terreno utilizzato per i saggi NTHi vivi sia privo di siero umano, in quanto ciò ucciderà i batteri. I campioni di siero animale (ad esempio, siero fetale di vitello) generalmente non causano alcun problema.
NOTA: Utilizzare i metodi descritti di seguito per analizzare campioni di tessuto standard come sangue periferico, campioni di broncoscopia (in particolare lavaggio broncoalveolare (BAL)) e tessuto polmonare resecato. Incubare i campioni con l'antigene Hi da 10 minuti a 24 ore o più.
2. Valutazione della funzione dei linfociti/mediatori infiammatori nel tessuto polmonare
- Di solito non è possibile ottenere un numero sufficiente di linfociti dalla broncoscopia; pertanto, utilizzare il tessuto polmonare dai campioni di lobectomia. L'ottimizzazione dei campioni di tessuto polmonare richiede uno stretto collegamento con il servizio di anatomia patologica. Assicurarsi che il tessuto abbia un margine di almeno 3 cm dal tumore e che sia il tessuto cellulare senza enfisema significativo (come determinato dal patologo).
- Rompere il tessuto polmonare in una sospensione cellulare prima che possa essere utilizzato per i saggi di citometria a flusso. Digerire chimicamente il tessuto polmonare (ad esempio, con collagenasi) o disaggregarlo meccanicamente.
nota: La disaggregazione meccanica del tessuto può essere preferita in quanto è associata a una migliore colorazione superficiale delle cellule (ad esempio, marcatura CD3/4).
- Ottenere campioni di lobectomia da un patologo (solitamente ottenuti da pazienti sottoposti a trattamento per cancro ai polmoni). Tagliare circa 20-40 g del campione in3 sezioni di 3-5 mm. Posizionarli all'interno di una camera sterile da 50 μL prima di essere frammentati meccanicamente utilizzando un apposito disaggregatore.
- Dopo la disaggregazione tissutale, lisare gli eritrociti con 10:1 (cioè 5 mL) di cloruro di ammonio allo 0,8% (150 mM di cloruro di ammonio (NH4Cl), 1 mM di bicarbonato di sodio (NaHCO3) e 0,1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
nota: In alternativa, è possibile utilizzare un sistema automatizzato come Q-prep.
- Risospendere le cellule in RPMI sterile (il volume dipenderà dal numero di cellule e generalmente è di 10-20 mL), quindi filtrarle attraverso una rete di nylon sterile da 100 μm. Conta il numero di cellule vitali utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano.
3. Test di infezione NTHi
- Risospendere le cellule polmonari a una concentrazione finale di 4 x 106 cellule/mL per provetta (campioni di controllo e stimolati).
- Utilizzare una sospensione di 4 x 106-6 x 106 cellule in 1 mL di RPMI per la provetta di controllo (negativa). Utilizzare la stessa quantità per la provetta NTHi (qualsiasi campione aggiuntivo può essere utilizzato come controllo positivo con il superantigene E dello stafilococco (SEB). Infettare le cellule nella provetta NTHi a un MOI di 100 batteri per cellula. Allentare il tappo di mezzo giro per consentire il trasferimento del gas nei tubi.
- Porre le cellule in un rotatore di provette e incubarle a 37 °C ruotandole a 12 giri/min.
- Per prevenire l'esportazione extracellulare di citochine, aggiungere un bloccante del Golgi (Brefeldina A) alle sospensioni cellulari 1 ora dopo la stimolazione fino a una concentrazione finale di 10 μg/mL. Riportare le sospensioni cellulari per un'ulteriore incubazione a rotazione di 16-22 ore.
- Lavare la sospensione cellulare con 500 μl di soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) contenente l'1% di albumina sierica bovina (BSA) e lo 0,01% di sodio azide, NaN3.
- Aggiungere gli anticorpi per la colorazione intracellulare delle citochine (la scelta degli anticorpi deve essere determinata dallo sperimentatore). Colorare la sospensione cellulare per specifici marcatori della superficie delle cellule linfocitarie umane (ad es. CD45, CD3, ecc.) per 1 ora. Lavare le celle con PBS, fissarle e permeabilizzarle.
- Fissare le cellule utilizzando 500 μL di paraformaldeide all'1%-2% per 1 ora.
- Contare le cellule con l'emocitometro, permeabilizzare10-6 cellule con 100 μl di saponina allo 0,1% per 15 minuti e incubare le cellule con anticorpi marcati con fluorescenza. Lavare le cellule e analizzarle con un citometro a flusso.
nota: La quantità di anticorpi marcati con fluorescenza sarà specifica per ciascuna citochina. Seguire le istruzioni del produttore. Tipicamente,10-6 cellule in 100 μL di soluzione vengono colorate per 1 ora. La maggior parte degli anticorpi ottenuti in commercio sarà sufficiente per eseguire 25-100 test.
- Incubare le cellule con anticorpi intracellulari di colorazione delle citochine (ad es. interferone-gamma, IFN-γ e fattore di necrosi tumorale beta, TNF-α o interleuchina, IL-13 e IL-17A) per 1 h.
nota: Si raccomanda di colorare prima i marcatori di superficie, poi intracellulari poiché la fissazione può causare cambiamenti conformazionali nelle proteine di superficie a cui si legano gli anticorpi.
- Lavare le cellule con 500 μL di PBS e risospendere in 100 μL di PBS prima dell'acquisizione dei dati su un citometro a flusso.