Determinazione della produzione di ROS da parte dei neutrofili in seguito all'interazione con biofilm opsonizzato

Abstract

Fonte: Rana, P. S. J. B., et al. Saggi in vitro standardizzati per visualizzare e quantificare le interazioni tra neutrofili umani e biofilm di Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2022)

In questo video, dimostriamo un test di chemiluminescenza in vitro per rilevare la generazione di specie reattive dell'ossigeno da parte dei neutrofili in seguito all'esposizione a un biofilm batterico opsonizzato.

Protocollo

1. Misurazione dei ROS prodotti dai neutrofili

1. Aggiungere 100 μl di siero umano normale al 20% (diluito in HBSS) goccia per goccia al biofilm lavato e incubare a 37 °C in condizioni statiche per 30 minuti per opsonizzare il biofilm.
2. Aspirare la soluzione di siero al 20% e lavare i biofilm goccia a goccia con 150 μL di HBSS una volta. Aspirare l'HBSS, lasciando dietro di sé pozzetti con biofilm opsonizzati.
   nota: Per l'interpretazione dell'esperimento, si raccomanda un minimo di quattro gruppi: (A) Neutrofili + Biofilm, (B) Neutrofili + PMA (controllo positivo, vedi Tabella dei materiali), (C) Solo neutrofili e (D) Solo biofilm.
3. Aggiungere luminol (vedi Tabella dei materiali) ai neutrofili risospesi in HBSS a una concentrazione di 4 x 10⁶ cellule/mL in modo tale che la concentrazione finale di luminol sia di 50 μM. Questa soluzione è pronta all'uso per i gruppi (A) e (C). Aggiungere 4 x 10⁵ neutrofili mescolati con luminol ai pozzetti con biofilm opsonizzati.
4. In una provetta separata, preparare una soluzione di luminol da 50 μM in HBSS senza neutrofili e aggiungerla al pozzetto contenente il biofilm (gruppo D).
5. Aliquotare 350 μL di neutrofili miscelati con luminol e aggiungere alla miscela il forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) alla concentrazione finale di 500 ng/mL. Per il gruppo (B), aggiungere 4 x 10⁵ neutrofili da questa miscela in pozzetti senza biofilm. Questo serve come controllo positivo.
   nota: La concentrazione di PMA indicata in questo passaggio è relativamente alta per garantire una robusta risposta allo scoppio poiché i neutrofili stimolati con PMA sono un controllo positivo. Il PMA può essere utilizzato a una concentrazione inferiore per attivare i neutrofili, a seconda dell'esperimento.
6. Centrifugare la piastra a 270 x g per 30 s a 4 °C.
7. Assicurarsi che il lettore di piastre sia impostato su 37 °C insieme all'impostazione della luminescenza e della lettura cinetica per 60 minuti con intervalli di 3 minuti. Posizionare la piastra nel lettore di piastre per misurare la produzione di ROS da parte dei neutrofili per 60 min.
   nota: Per questo test, i biofilm sono stati coltivati in piastre bianche utilizzate per i saggi di luminescenza. La PMA è un noto agonista per la risposta ossidativa allo scoppio. Quando si eseguono studi che coinvolgono la PMA, assicurarsi che la PMA venga aggiunta nella fase finale mentre la soluzione contenente neutrofili è fredda poiché la PMA avvia immediatamente la risposta di scoppio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette da centrifuga coniche da 50 mL	Termo Scientifico	339652
Tampone imbevuto di alcol	Bd		Utilizzato per il prelievo di sangue
Contatore di celle	Fornitura di balle	202C
Piastre in polistirene a fondo piatto a 96 pozzetti con fondo trasparente	Costar	3370
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) 1x	Gibco	Codice 14190-144
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-CV	Senza calcio, magnesio e rosso fenolo
Emocitometro	Linea luminosa
Luminol	sigma	A8511-5G
Media essenziali minimi (MEM) Alpha 1x	Gibco	Codice 41061-029
Siero umano normale	Tecnologia complementare	Nhs
Piastra di Petri (100 x 15 mm)	VWR	Codice 25384-342
Phorbol 12-miristato 13-acetato
Soluzione di poli-L-lisina	sigma	P4707-50ML
Software SoftMax Pro	Dispositivi molecolari		Software di lettura per micropiastre utilizzato per l'acquisizione dei dati
SpectraMax i3x	Dispositivi molecolari		Lettore di micropiastre