Un test in vitro per studiare l'interazione tra neutrofili e biofilm

Abstract

Fonte: Rana, P. S. J. B., et al. Saggi in vitro standardizzati per visualizzare e quantificare le interazioni tra neutrofili umani e biofilm di Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra un test in vitro per studiare l'interazione neutrofilo-biofilm. I batteri patogeni incorporati nel biofilm e i neutrofili isolati sono stati marcati utilizzando etichette fluorescenti e la risposta immunitaria dei neutrofili e l'evasione della risposta immunitaria da parte dei batteri sono state valutate utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Protocollo

1. Preparazione del biofilm in vitro

1. Ottenere colonie isolate di S. aureus da un ceppo crioconservato utilizzando una tecnica a striature su una piastra di agar ricca di sostanze nutritive, come l'agar di soia triptico (vedi Tabella dei materiali).
2. Rivestire i singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con 100 μL di poli-L-lisina (PLL) allo 0,001% (v/v) diluita in H₂O sterile e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Aspirare asetticamente la soluzione PLL utilizzando una trappola per aspirazione assistita dal vuoto. Lasciare asciugare i pozzetti per una notte a temperatura ambiente.
   nota: Tutte le fasi di aspirazione del protocollo vengono eseguite utilizzando una trappola di aspirazione assistita dal vuoto, se non diversamente specificato.
3. Preparare una coltura notturna inoculando una colonia di S. aureus in terreno alfa essenziale minimo (MEMα) integrato con glucosio al 2% e incubare a 37 °C, agitando a 200 giri/min per 16-18 ore.
4. Diluire la coltura durante la notte trasferendo da 50 μL a 5 mL di MEMα fresco integrato con glucosio al 2% e incubare a 37 °C, agitando a 200 giri/min, fino alla metà della fase logaritmica, generalmente compresa tra una densità ottica di 600 (OD₆₀₀nm) di 0,5-0,8. Utilizzare MEMα per normalizzare la coltura medio-logaritmica a un OD₆₀₀nm di 0,1.
5. Trasferire 150 μl di coltura normalizzata in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti trattata con PLL. Incubare staticamente per 18-20 ore in camera umidificata a 37 °C.
   nota: I biofilm possono essere coltivati anche in altri formati, come i vetrini a μ canali (vedi Tabella dei materiali).
6. Aspirare il surnatante per rimuovere le cellule planctoniche. Lavare delicatamente la biomassa rimanente con 150 μl di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) per rimuovere le cellule non attaccate. Aggiungere HBSS in modo graduale per evitare di interrompere il biofilm.
   nota: Durante l'aspirazione del surnatante e dell'HBSS durante i lavaggi, lasciare una quantità sufficiente di liquido (surnatante o HBSS) nei pozzetti contenenti il biofilm in modo che il biofilm sia ancora immerso. Ciò impedisce l'interruzione della struttura del biofilm quando l'HBSS viene aggiunto goccia a goccia per lavare il biofilm.
7. Ripetere il passaggio 1.6 almeno altre due volte per rimuovere tutte le cellule planctoniche. A questo punto, i biofilm sono pronti per gli esperimenti a valle immediati.
   nota: Se i biofilm non vengono utilizzati per esperimenti sui neutrofili, l'HBSS può essere sostituito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). L'HBSS è preferito al PBS poiché l'HBSS contiene componenti, incluso il glucosio, che forniscono le condizioni ottimali per l'attivazione dei neutrofili.

2. Isolamento dei neutrofili

NOTA: I neutrofili sono stati isolati seguendo un metodo precedentemente pubblicato con piccole modifiche. Questo protocollo di isolamento combina prima la centrifugazione in gradiente di densità, seguita dalla sedimentazione del destrano al 3%. Questa sezione copre solo il protocollo generale di isolamento dei neutrofili, concentrandosi sulle modifiche apportate al protocollo pubblicato. Inoltre, il protocollo descritto di seguito è uno dei tanti metodi in grado di isolare i neutrofili e può essere sostituito secondo necessità. Altri metodi per isolare i neutrofili includono l'uso di mezzi di separazione cellulare o la separazione cellulare con anticorpi magnetici.

1. Prelevare il sangue da un donatore adulto tramite venipuntura, secondo il protocollo delineato nell'IRB istituzionale. Prima del prelievo di sangue, assicurarsi che la siringa contenga una quantità sufficiente di eparina priva di conservanti, in modo tale che la concentrazione finale di eparina sia di 20 U/mL.
2. Diluire il sangue eparinizzato con 3/4 del volume di NaCl allo 0,9% privo di endotossine (vedere Tabella dei materiali) in H₂O a temperatura ambiente.
3. Per ogni 20 mL di campione di sangue diluito, aliquotare 14 mL di un terreno a gradiente di densità disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali) in una provetta conica fresca da 50 mL. Sovrapporre con cura il campione di sangue diluito sopra il mezzo di gradiente di densità.
4. Centrifugare il campione di sangue stratificato a 400 x g per 40 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi che la centrifuga abbia una pausa lenta per evitare di disturbare lo strato una volta completata la centrifugazione.
   nota: Il campione di sangue avrà cinque strati contenenti una miscela di soluzione salina e plasma, uno strato di cellule mononucleate, un mezzo di gradiente di densità, neutrofili ed eritrociti.
5. Utilizzando una pipetta sierologica, aspirare tutti gli strati sopra i neutrofili e il pellet eritrocitario, seguito da una delicata risospensione del pellet in NaCl 0,9% freddo privo di endotossine in H₂O. Per ogni pellet generato da un campione di sangue da 20 mL, risospendere il pellet fino a un volume totale di 20 mL. Aggiungere un volume 1:1 di destrano al 3% (vedere la tabella dei materiali). Incubare la provetta in posizione verticale per 18-20 minuti con ghiaccio.
   nota: Assicurati che il destrano al 3% sia prodotto con NaCl allo 0,9% in H₂O privo di endotossine.
6. Rimuovere 20 mL dello strato superiore che contiene neutrofili e alcuni eritrociti su una nuova provetta conica da 50 mL e centrifugarla a 355 x g per 10 min a 4 °C. Versare il surnatante lasciando dietro di sé una pallina rossa.
7. Risospendere delicatamente il pellet in 10 mL di H₂O freddo e sterile per 30 secondi per lisare gli eritrociti rimanenti. Aggiungere immediatamente 10 mL di soluzione salina fredda allo 0,9% priva di endotossine alla miscela per ripristinare la tonicità. Centrifugare la soluzione a 233 x g per 3 minuti a 4 °C.
8. Versare il surnatante e risospendere il pellet contenente il 95%-97% di neutrofili in 1 mL di HBSS freddo per 20 mL di campione di sangue.
9. Trasferire 10 μL di neutrofili risospesi in 90 μL di colorante di esclusione blu di tripano allo 0,4% e contare le cellule utilizzando un emocitometro (vedi Tabella dei materiali).
   nota: Le cellule non vitali sono colorate di blu come il colorante di esclusione del blu di tripano è impermeabile nelle cellule vitali. Questo protocollo fornisce una vitalità cellulare del >99%.
10. Aggiungere ulteriore HBSS in modo tale che la concentrazione finale di neutrofili sia 4 x 10⁶ cellule/mL.
    nota: Per i casi con una vitalità cellulare del <99%, è ancora possibile raggiungere la concentrazione finale di 4 x 10⁶ cellule/mL; tuttavia, il volume totale della soluzione contenente 4 x 10⁶ cellule/mL ottenuto diminuirà. La concentrazione finale di neutrofili può essere regolata in base alle esigenze sperimentali dell'utente. I neutrofili sono stati risospesi a una concentrazione finale di 4 x 10⁶ cellule/mL per tutti gli esperimenti descritti di seguito. Per tenere conto della variabilità da donatore a donatore, si raccomanda vivamente che tutti gli esperimenti coinvolti con i neutrofili siano eseguiti con almeno tre donatori diversi.

3. Imaging delle interazioni biofilm-neutrofili

1. Imposta un biofilm utilizzando i passaggi 1.2-1.6. Per facilitare l'imaging del biofilm, utilizzare un ceppo fluorescente di S. aureus, come USA300 che esprime la proteina fluorescente verde (GFP), per aumentare la facilità di imaging al microscopio.
   nota: Per dimostrare il modello di biofilm in vitro è stato utilizzato un vetrino a 6 canali μ (vedi Tabella dei materiali) al posto di una piastra a 96 pozzetti (fase 1).
2. Incubare 4 x 10⁶ cellule/mL di neutrofili con 100 μM di colorante Blue CMAC (7-ammino-4-clorometilcumarina) (BCD, vedi Tabella dei materiali) per 30 minuti in un bilanciere a 37 °C e 5% CO₂. Assicurarsi che i campioni siano incubati al buio e limitare l'esposizione alla luce per le fasi rimanenti.
3. Per lavare il BCD in eccesso, centrifugare i neutrofili a 270 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere i neutrofili in HBSS fresco. A questo punto, aggiungere l'omodimero di etidio-1 (vedi Tabella dei materiali) ai neutrofili colorati con BCD a una concentrazione finale di 4 μM per monitorare la morte dei neutrofili e dei batteri.
4. Aggiungere 150 μL di neutrofili al biofilm di S. aureus che è stato coltivato in vetrini di μ, in modo tale che il rapporto neutrofili/batteri sia 1:30 (neutrofili: batteri). Incubare i vetrini μ in una camera umidificata per 30 minuti. Il numero di cellule batteriche si basa sulla conta cellulare ottenuta dalla piastratura di un biofilm di 18 ore.
5. Immagine dell'interazione neutrofilo-biofilm utilizzando canali fluorescenti corrispondenti alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dei coloranti/proteine fluorescenti.
   nota: Per il presente studio, la BCD è di 353/466 nm, l'omodimero di etidio-1 è di 528/617 nm e la GFP è di 395/509 nm. Limitare l'esposizione del campione al laser o alla luce per evitare il fotosbiancamento dei campioni.
6. Analizza le immagini utilizzando software di analisi delle immagini al microscopio o programmi come FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ e BAIT, tra molti altri.
   nota: Quando si lavora con le macchie, è importante considerare la specificità dei coloranti in uso. Alcune colorazioni funzionano sulle cellule procariotiche ed eucariotiche, mentre altre funzionano solo su una. Se i neutrofili e i biofilm vengono colorati separatamente utilizzando coloranti in grado di colorare entrambi i tipi di cellule, assicurarsi di lavare via il colorante rimanente prima di combinare neutrofili e biofilm per evitare la colorazione incrociata.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Irrigazione con cloruro di sodio allo 0,9%, USP	Baxter	Codice 2F7124	Senza endotossine; Utilizzato per l'isolamento dei neutrofili
Unità filtrante a flusso rapido da 150 mL	Termo Scientifico	Codice 565-0020
Etanolo a 200 gradi	VWR	Codice 89125-188
Siringa da 3 ml	Bd	309657	Utilizzato per il prelievo di sangue
Provette da centrifuga coniche da 50 mL	Termo Scientifico	339652
Siringa da 60 ml	Bd	309653	Utilizzato per il prelievo di sangue
agar	Fisher Bioreagenti	BP1423-2
Tampone imbevuto di alcol	Bd		Utilizzato per il prelievo di sangue
Cerotti			Utilizzato per il prelievo di sangue
BD Bacto Brodo di soia trittico	Bd	DF0370-07-5	Combina con l'1,5% di agar per ottenere l'agar di soia triptico
Contatore di celle	Bal Saupply	202C
CellTracker blu CMCH	Invitrogen	Visualizzazione del materiale C2111	Colorante CMAC blu (BCD)
Piastre in polistirene a fondo piatto a 96 pozzetti con fondo trasparente	Costar	3370
Garza di cotone	Fisherbrand	13-761-52	Utilizzato per il prelievo di sangue
Provette per coltura	Fisherbrand	14-961-27	Vetro borosilicato 13 x 100 mm
D-(+)-glucosio	sigma	G-8270
Destrano da Leuconostoc spp.	sigma	31392-250G	Utilizzato per l'isolamento dei neutrofili
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) 1x	Gibco	Codice 14190-144
Omodidimero di etidio-1	Invitrogen	L3224 B
Ficoll-Paque plus	Citiva	17144003	Utilizzato per l'isolamento dei neutrofili (mezzo a gradiente di densità)
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-CV	Senza calcio, magnesio e rosso fenolo
Emocitometro	Linea luminosa
eparina	Novaplus	NDC 63323-540-57	1000 unità USP/mL, utilizzato per il prelievo di sangue
IMARIS 9.8	Strumenti Oxford		Software di analisi delle immagini per microscopia
Media essenziali minimi (MEM) Alpha 1x	Gibco	Codice 41061-029
Ago (23 G1)	Bd	305145	Utilizzato per il prelievo di sangue
Nikon Eclissi Ti2	Nikon
Elementi NIS	Nikon		Quantificazione dei neutrofili morti
Soluzione di poli-L-lisina	sigma	P4707-50ML
cloruro di sodio	Fisher Bioreagenti	BP358-10	Utilizzato per l'isolamento dei neutrofili
Acqua sterile per irrigazione, USP	Baxter	Codice 2F7114	Senza endotossine; Utilizzato per l'isolamento dei neutrofili
Set per infusione alata Surflo	Terumo	SC*19BLK	19 G x 3/4", utilizzato per il prelievo di sangue
Macchia blu di tripano (0,4%)	Gibco	Codice 15250-061
Tornitura			Utilizzato per il prelievo di sangue
Acqua distillata ultrapura	Invitrogen	10977015
Piastre bianche opache a 96 pozzetti	Falcone	353296	Coltura tissutale trattata e piastra a fondo piatto
μ-Slide VI 0.4	Ibidi	Codice 80601	Scivolo a μ canali