Valutazione della colite indotta da sostanze chimiche mediante analisi immunoistochimica di sezioni di tessuto del colon

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione di Topi e DSS

1. Tenere i topi knockout (α-gustducin^-/-) e i topi C57BL/6 con controllo wild-type abbinato per età, sesso e peso corporeo (α-gustducin^+/+) individualmente in gabbie pulite.
   nota: I topi knockout sono stati reincrociati con topi C57BL/6 per oltre 20 generazioni e hanno un background genetico quasi al 100% di C57BL/6.
2. Sciogliere 30 g di destrano solfato di sodio (DSS) in polvere in 1 L di acqua autoclavata. Mescolare fino a quando la soluzione diventa limpida per garantire che la concentrazione finale di lavoro sia del 3% (p/v).
   nota: La soluzione DSS può essere conservata a temperatura ambiente per un massimo di 1 settimana o a 4 °C fino all'uso.

2. Induzione e valutazione della colite DSS nei topi

1. Pesa e registra il peso corporeo iniziale di ogni topo. Metti i topi singolarmente in gabbie di plastica standard ed etichetta le gabbie.
2. Sostituire l'acqua potabile normale con una soluzione di DSS al 3% per un totale di 7 giorni a cui entrambi i gruppi di topi hanno accesso ad libitum.
3. Misurare il peso corporeo del topo, registrare il consumo di soluzione DSS e raccogliere ed esaminare le feci di ciascun topo ogni giorno durante la somministrazione del DSS. Osservare la gravità della diarrea e del sanguinamento rettale e convertirla nell'indice di malattia indotta dal DSS.
4. Durante l'esperimento, la percentuale di perdita di peso rispetto al peso iniziale e l'indice di malattia vengono calcolati per valutare i sintomi della colite.
   nota: L'indice di malattia viene valutato combinando le osservazioni di diarrea e sanguinamento rettale ed è definito come segue: 0 (feci normali, senza sangue), 1 (feci molli, senza sangue), 2 (feci molli, poco sangue), 3 (feci molto molli, sanguinamento modesto) e 4 (feci acquose, sanguinamento significativo). L'indice di malattia viene analizzato quotidianamente per ogni topo.
5. Entro la fine del trattamento DSS di 7 giorni, sacrificare i topi mediante lussazione cervicale e procedere con gli esperimenti rimanenti.

3. Preparazione dei campioni di tessuto

1. Metti il mouse in posizione supina e pulisci la pelle dell'addome con etanolo al 70%. Praticare un'incisione della linea mediana lunga 3 cm nell'addome con un paio di piccole forbici per esporre la cavità addominale.
2. Usa un paio di pinze per separare con cura la milza dagli altri tessuti, quindi rimuovi la milza e misurane le dimensioni.
3. Identificare e sollevare il colon con una pinza e separarlo dal mesentere circostante. Estrarre l'intero colon fino a quando il cieco e il retto sono visibili.
4. Isolare il colon sezionandolo al margine coloncecale e in profondità nel bacino per liberare rispettivamente il colon prossimale e distale. Quindi, misurare e registrare la lunghezza del colon isolato. Fare attenzione a non danneggiare il tessuto del colon durante la procedura di dissezione.
5. Sciacquare il colon con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) con una siringa da 10 ml dotata di ago per rimuovere le feci e il sangue fino a quando l'eluato non è completamente limpido.
6. Per l'identificazione istologica, dividere i campioni di tessuto in parti uguali in tre parti: prossimale, media e distale. Quindi, fissare il tessuto con paraformaldeide (PFA) al 4% per una notte a 4 °C.
7. Per l'analisi dell'espressione delle citochine, congelare rapidamente l'intero colon con azoto liquido e conservarlo a -80 °C fino al momento dell'uso.

4. Valutazione istologica della gravità della colite indotta da DSS

1. Immunoistochimica
   1. Dopo la fissazione, immergere il tessuto in una soluzione di saccarosio al 30% in 1x PBS per una notte in una provetta da 15 ml per crioproteggere i campioni.
   2. Incorporare il tessuto nel composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) e posizionarlo a -20 °C fino a quando l'OCT non si indurisce.
   3. Trasferire il blocco OCT contenente il tessuto in un criostato, impostare la manopola dello spessore nel criostato a 12 μm e affettare e raccogliere sezioni congelate spesse 12 μm.
   4. Riscaldare le sezioni di tessuto raccolte da un criostato a 65 °C per 20 minuti su una piastra calda. Lavare le sezioni in 1x PBS 3 volte, per 10 minuti ciascuna. Incubare le sezioni di tessuto in perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti per eliminare la perossidasi endogena. Lavare le sezioni altre 3 volte. Bloccare i tessuti con tampone bloccante (3% di albumina sierica bovina (BSA), 0,3% di detergente non ionico, 2% di siero di capra, 0,1% di sodio azide in 1x PBS) a temperatura ambiente per 1 ora o più.
   5. Sostituire il tampone bloccante con una soluzione contenente i seguenti anticorpi primari specifici per il tipo di cellula immunitaria: CD45 per i leucociti, CD3 per le cellule T, B220 per le cellule B, CD11b per i macrofagi e Ly6G per i neutrofili. Incubare a 4 °C per una notte.
   6. Rimuovere gli anticorpi primari dalle sezioni di tessuto mediante aspirazione. Lavare le sezioni con 1 PBS 3 volte, per 10 minuti ciascuna. Incubare le sezioni con anticorpo secondario biotinilato seguito da incubazione con il complesso streptavidina-HRP a temperatura ambiente.
   7. Incubare le sezioni con una soluzione di 3,3'-diaminobenzidina (DAB) per sviluppare un colore marrone chiaro o scuro e visualizzare le cellule immunoreattive.
   8. Controcolorare le sezioni con ematossilina e ammoniaca diluita allo 0,3% (v/v). Scatta immagini in campo chiaro con un ingrandimento 10X al microscopio.
   9. Utilizzare un programma di elaborazione delle immagini per identificare e quantificare la popolazione delle cellule immunitarie marcate sia nell'epitelio che nella lamina propria (sotto l'epitelio) impostando 2 maschere: utilizzare la prima maschera nella funzione basata sul cubo di colore per impostare una soglia di rilevamento del colore e misurare le aree colorate reattive al DAB; utilizzare la seconda maschera per determinare le aree totali dell'epitelio e della lamina propria nella sezione esaminata. Esprimere la popolazione cellulare immunoreattiva come rapporto tra l'area di colorazione delle cellule infiltrate e l'area totale del tessuto esaminato.