Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di Topi e DSS
- Tenere i topi knockout (α-gustducin-/-) e i topi C57BL/6 con controllo wild-type abbinato per età, sesso e peso corporeo (α-gustducin+/+) individualmente in gabbie pulite.
nota: I topi knockout sono stati reincrociati con topi C57BL/6 per oltre 20 generazioni e hanno un background genetico quasi al 100% di C57BL/6.
- Sciogliere 30 g di destrano solfato di sodio (DSS) in polvere in 1 L di acqua autoclavata. Mescolare fino a quando la soluzione diventa limpida per garantire che la concentrazione finale di lavoro sia del 3% (p/v).
nota: La soluzione DSS può essere conservata a temperatura ambiente per un massimo di 1 settimana o a 4 °C fino all'uso.
2. Induzione e valutazione della colite DSS nei topi
- Pesa e registra il peso corporeo iniziale di ogni topo. Metti i topi singolarmente in gabbie di plastica standard ed etichetta le gabbie.
- Sostituire l'acqua potabile normale con una soluzione di DSS al 3% per un totale di 7 giorni a cui entrambi i gruppi di topi hanno accesso ad libitum.
- Misurare il peso corporeo del topo, registrare il consumo di soluzione DSS e raccogliere ed esaminare le feci di ciascun topo ogni giorno durante la somministrazione del DSS. Osservare la gravità della diarrea e del sanguinamento rettale e convertirla nell'indice di malattia indotta dal DSS.
- Durante l'esperimento, la percentuale di perdita di peso rispetto al peso iniziale e l'indice di malattia vengono calcolati per valutare i sintomi della colite.
nota: L'indice di malattia viene valutato combinando le osservazioni di diarrea e sanguinamento rettale ed è definito come segue: 0 (feci normali, senza sangue), 1 (feci molli, senza sangue), 2 (feci molli, poco sangue), 3 (feci molto molli, sanguinamento modesto) e 4 (feci acquose, sanguinamento significativo). L'indice di malattia viene analizzato quotidianamente per ogni topo.
- Entro la fine del trattamento DSS di 7 giorni, sacrificare i topi mediante lussazione cervicale e procedere con gli esperimenti rimanenti.
3. Preparazione dei campioni di tessuto
- Metti il mouse in posizione supina e pulisci la pelle dell'addome con etanolo al 70%. Praticare un'incisione della linea mediana lunga 3 cm nell'addome con un paio di piccole forbici per esporre la cavità addominale.
- Usa un paio di pinze per separare con cura la milza dagli altri tessuti, quindi rimuovi la milza e misurane le dimensioni.
- Identificare e sollevare il colon con una pinza e separarlo dal mesentere circostante. Estrarre l'intero colon fino a quando il cieco e il retto sono visibili.
- Isolare il colon sezionandolo al margine coloncecale e in profondità nel bacino per liberare rispettivamente il colon prossimale e distale. Quindi, misurare e registrare la lunghezza del colon isolato. Fare attenzione a non danneggiare il tessuto del colon durante la procedura di dissezione.
- Sciacquare il colon con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) con una siringa da 10 ml dotata di ago per rimuovere le feci e il sangue fino a quando l'eluato non è completamente limpido.
- Per l'identificazione istologica, dividere i campioni di tessuto in parti uguali in tre parti: prossimale, media e distale. Quindi, fissare il tessuto con paraformaldeide (PFA) al 4% per una notte a 4 °C.
- Per l'analisi dell'espressione delle citochine, congelare rapidamente l'intero colon con azoto liquido e conservarlo a -80 °C fino al momento dell'uso.
4. Valutazione istologica della gravità della colite indotta da DSS
- Immunoistochimica
- Dopo la fissazione, immergere il tessuto in una soluzione di saccarosio al 30% in 1x PBS per una notte in una provetta da 15 ml per crioproteggere i campioni.
- Incorporare il tessuto nel composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) e posizionarlo a -20 °C fino a quando l'OCT non si indurisce.
- Trasferire il blocco OCT contenente il tessuto in un criostato, impostare la manopola dello spessore nel criostato a 12 μm e affettare e raccogliere sezioni congelate spesse 12 μm.
- Riscaldare le sezioni di tessuto raccolte da un criostato a 65 °C per 20 minuti su una piastra calda. Lavare le sezioni in 1x PBS 3 volte, per 10 minuti ciascuna. Incubare le sezioni di tessuto in perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti per eliminare la perossidasi endogena. Lavare le sezioni altre 3 volte. Bloccare i tessuti con tampone bloccante (3% di albumina sierica bovina (BSA), 0,3% di detergente non ionico, 2% di siero di capra, 0,1% di sodio azide in 1x PBS) a temperatura ambiente per 1 ora o più.
- Sostituire il tampone bloccante con una soluzione contenente i seguenti anticorpi primari specifici per il tipo di cellula immunitaria: CD45 per i leucociti, CD3 per le cellule T, B220 per le cellule B, CD11b per i macrofagi e Ly6G per i neutrofili. Incubare a 4 °C per una notte.
- Rimuovere gli anticorpi primari dalle sezioni di tessuto mediante aspirazione. Lavare le sezioni con 1 PBS 3 volte, per 10 minuti ciascuna. Incubare le sezioni con anticorpo secondario biotinilato seguito da incubazione con il complesso streptavidina-HRP a temperatura ambiente.
- Incubare le sezioni con una soluzione di 3,3'-diaminobenzidina (DAB) per sviluppare un colore marrone chiaro o scuro e visualizzare le cellule immunoreattive.
- Controcolorare le sezioni con ematossilina e ammoniaca diluita allo 0,3% (v/v). Scatta immagini in campo chiaro con un ingrandimento 10X al microscopio.
- Utilizzare un programma di elaborazione delle immagini per identificare e quantificare la popolazione delle cellule immunitarie marcate sia nell'epitelio che nella lamina propria (sotto l'epitelio) impostando 2 maschere: utilizzare la prima maschera nella funzione basata sul cubo di colore per impostare una soglia di rilevamento del colore e misurare le aree colorate reattive al DAB; utilizzare la seconda maschera per determinare le aree totali dell'epitelio e della lamina propria nella sezione esaminata. Esprimere la popolazione cellulare immunoreattiva come rapporto tra l'area di colorazione delle cellule infiltrate e l'area totale del tessuto esaminato.
