Uccisione delle cellule K562 da parte delle cellule mononucleate del sangue periferico esposte a preparazioni di prodotti del tabacco

Abstract

Fonte: Arimilli, S. et al., Metodi per valutare la citotossicità e l'immunosoppressione delle preparazioni di prodotti del tabacco combustibili. J. Vis. Exp. (2015)

In questo video, studiamo l'effetto di un intero mezzo condizionato dal fumo, un preparato di prodotti del tabacco combustibile, sull'uccisione delle cellule K562 da parte delle cellule mononucleate del sangue periferico effettore.

Protocollo

1. Saggio di uccisione K562

NOTA: Le cellule K562 devono essere coltivate in coltura a 37 °C e 5% di CO₂ con terreno completo RPMI fino a raggiungere l'80% di confluenza prima del test.

1. Preparare una soluzione madre di 5 mM di carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE) aggiungendo 18 μl di DMSO al flaconcino.
2. Diluire il WS-CM o la nicotina in una piastra a 96 pozzetti utilizzando il terreno completo RPMI fino a un volume totale di 100 μl/pozzetto per ottenere le unità di equi-nicotina o le concentrazioni di nicotina desiderate per ciascun pozzetto.
   cautela: La nicotina è estremamente tossica e pericolosa per l'ambiente.
3. Aggiungere 100 μl di PBMC nel terreno completo RPMI a una concentrazione di 1,5 x 10⁶ cellule/pozzetto. Il volume totale delle cellule con WS-CM o nicotina sarà di 200 μl/pozzetto.
4. Coprire la piastra e incubare per 3 ore a 37 °C e 5% di CO₂.
5. Lavare le cellule K562 aggiungendo 10 ml di DPBS e centrifugare a 400 x g per 8 min a RT.
6. Risospendere le cellule con 10 ml di DPBS e contare le cellule K562.
7. Preparare una soluzione di lavoro CFSE aggiungendo 1 μl di soluzione madre CFSE a 1 ml di DPBS.
8. Aggiungere 1 ml della soluzione di lavoro CFSE a 1 ml della sospensione cellulare K562 contenente 1 - 2 x 10⁷ cellule. Agitare e incubare con precisione per 2 minuti a RT.
9. Aggiungere immediatamente 200 μl di FBS. Agitare e incubare con precisione per 2 minuti a RT.
10. Aggiungere 10 ml di terreno completo RPMI e centrifugare la provetta a 400 x g per 8 minuti a RT.
11. Rimuovere il surnatante RPMI, rompere il pellet, risospendere le cellule con 10 ml di terreno completo RPMI e contare le cellule K562 marcate con CFSE.
12. Lavare i PBMC centrifugando la piastra a 300 x g per 3 minuti a RT. Aspirare il surnatante travasando il liquido. Riposizionare il coperchio e vorticare la parte inferiore della piastra. Aggiungere 200 μl di terreno completo RPMI e ripetere la fase di lavaggio ancora una volta.
13. Aggiungere cellule K562 marcate con CFSE a un rapporto di 1:15 (100.000 K562s:1,5 x 10⁶ PBMCs) a ciascun pozzetto del campione della piastra PBMC e incubare ulteriormente per 5 ore a 37 °C e 5% CO₂.
14. Lavare la miscela cellulare centrifugando a 300 x g per 3 minuti a RT. Aspirare il surnatante scartando il liquido. Posizionare il coperchio e far vorticare il fondo del piatto.
15. Aggiungere 200 μl di tampone di scorrimento e ripetere ancora una volta la fase di lavaggio descritta al punto 14.
16. Aggiungere 95 μl di tampone di corsa seguiti da 5 μl di 7AAD a ciascun pozzetto per un volume totale di 100 μl/pozzetto. Incubare la piastra al buio a RT per 15 minuti.
17. Aggiungere 100 μl di tampone di corsa a ciascun pozzetto e trasferire l'intero volume di sospensione cellulare da ciascun pozzetto della piastra alle provette a grappolo e acquisire i campioni sul citometro a flusso.
18. Determinare la percentuale di cellule 7AAD-positive e CFSE-positive utilizzando il software di analisi della citometria a flusso.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
12 X 75 tubi	Falco BD	352058
Tubi conici da 15 ml	Corning	Numero 430790
2 mL di microprovette	Axygen	MCT-150-C-S
Tubi conici da 50 ml	Corning	430828
Flacone da 500 ml	Corning	430282
7AAD	BD Pharmingen	559925
Piastra a fondo piatto a 96 pozzetti	Termo Nunc	439454
Piastre a fondo tondo a 96 pozzetti	Falco BD	353077
Cappa per coltura cellulare	Termo Scientifico	Serie 1300 A2
centrifuga	Eppendorf	58110R
CFSE	Sonde Molecolari Life Technologies	Codice C34554
Tubi a grappolo	Corning	4401	Nocivo se ingerito, cancerogeno
DMSO (dimetilsolfossido )	Sigma-Aldrich	D8418
DPBS	Lonza	17-512F
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Unità filtrante	Nalgene	Codice 156-4020
Citometro a flusso	BD Bioscienze	FACS Canto II	8 colori a Ex 405 nm e Em785 nm.
Citometro a flusso	BD Bioscienze	FACS Calibur	4 colori a Ex 495 nm e Em 785 nm.
Software di analisi per citometria a flusso	Stella dell'albero	Flusso Jo
nicotina	Sigma-Aldrich	N3876	Tossicità acuta, pericolo ambientale
Parafilm	Bemis	"M"
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148	Infiammabile, Irritazione della pelle
Penna/streptococco	Tecnologie Gibco Life	Codice: 15140-122
RPMI 1640	Tecnologie Gibco Life	Codice 11875-093
Buffer in esecuzione	Tampone di corsa MACS, Miltenyi Biotech	130-091-221
Pipetta di trasferimento	Fisher Scientifico	13-711-20
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503