Una tecnica in vitro per studiare trattamenti antimicrobici su aggregati batterici

Abstract

Fonte: Gannon, A. D., et al. Strumenti per la valutazione in tempo reale di un modello di infezione da Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra una tecnica in vitro per studiare l'impatto del trattamento antimicrobico sugli aggregati di Pseudomonas aeruginosa (Pa). Le cellule Pa marcate in fluorescenza vengono coltivate come aggregati, imitando il modello di crescita durante l'infezione. Dopo aver sfidato gli aggregati con una concentrazione subletale dell'antibiotico colistina, la valutazione in tempo reale dell'interazione batterio-antibiotico viene eseguita tramite microscopia a fluorescenza.

Protocollo

1. Preparare il terreno sintetico per la fibrosi cistica (SCFM2)

NOTA: La preparazione di SCFM2 comprende tre fasi principali descritte di seguito (Figura 1).

1. Sterilizzazione della mucina suina
   1. Preparare mucina sterile a una concentrazione finale di 5 mg/mL in SCFM2. Ad esempio, per un volume di 5 ml di SCFM2, pesare 25 mg di mucina di tipo II in una piastra di Petri sterile e immergerla in uno sterilizzatore a raggi ultravioletti (UV) per 4 ore, agitando delicatamente ogni ora.
   2. Dopo 4 ore, trasferire la mucina trattata con raggi UV in provette autoclavate....

Risultati

Figura 1: Preparazione e inoculazione del terreno SCFM2. (A) La base tamponata è preparata utilizzando i sali e gli amminoacidi elencati nella Tabella 1 e nella Tabella 2. La base tamponata può essere conservata a 4 °C per un massimo di 30 giorni, ma deve essere protetta dall'esposizione alla luce. (B) La mucina e il DNA vengono aggiunti a un'aliquota di base tamponata e disciolti in soluzione per un.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Aminoacidi
alanina	Acrs Organics	56-41-7
Arginina HCl	Mp	Codice 1119-34-2
asparagina	Acrs Organics	56-84-8	Preparato in 0,5 m di NaOH
Cistina HCl	Alfa Aesar	L06328
Acido glutammico HCl	Acrs Organics	138-15-8
glicina	Acrs Organics	56-40-6
Istidina HCl H2O	Alfa Aesar	Codice: A17627
isoleucina	Acrs Organics	73-32-5
leucina	Alfa Aesar	Codice A12311
Lisina HCl	Alfa Aesar	J62099
metionina	Acrs Organics	63-68-3
Ornitina HCl	Alfa Aesar	Codice: A12111
fenilalanina	Acrs Organics	63-91-2
prolina	Alfa Aesar	Codice: A10199
serina	Alfa Aesar	Codice: A11179
treonina	Acrs Organics	72-19-5
triptofano	Acrs Organics	73-22-3	Preparato in 0,2 m di NaOH
tirosina	Alfa Aesar	Codice: A11141	Preparato in 1,0 m NaOH
valina	Acrs Organics	72-18-4
antibiotico
Carbenicillina	Alfa Aesar	J6194903
Giorno di Scorte
CaCl2* 6H2O	Fisher Chemical	C79-500
Destrosio (D-glucosio)	Fisher Chemical	50-99-7
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)	Fisher (Avanti Polar Lipids)	4235-95-4	Agitare 15-20 minuti a 37 °C per far evaporare il cloroformio
FeSO4 * 7H2O	Acrs Organics	7782-63-0	Questo stock è pari a 1 mg/mL, DEVE fare fresco
Acido L-lattico	Alfa Aesar	L13242	pH stock a 7 con NaOH
MgCl2 * 6H2O	Acrs Organics	7791-18-6
N-acetilglucosamina	TCI	Codice: A0092
Solidi preparati
Mucina suina	sigma	Codice: M1778-100G	Sterilizzazione UV
DNA spermatico di salmone	Invitrogen	Codice 15632-011
macchia
Ioduro di propidio	Alfa Aesar	J66764MC
sali
K2SO4	Alfa Aesar	Codice A13975
Kcl	Alfa Aesar	J64189	Aggiungi solido direttamente alla base bufferizzata
KNO3	Acrs Organics	7757-79-1
Mops	Alfa Aesar	Codice: A12914	Aggiungi solido direttamente alla base bufferizzata
NaCl	Fisher Chemical	Episodio 271-500	Aggiungi solido direttamente alla base bufferizzata
Na2HPO4	Rpi	S23100-500.0
NaH2PO4	Rpi	Codice: S23120-500.0
NH4Cl	Acrs Organics	Codice 12125-02-9	Aggiungi solido direttamente alla base bufferizzata
Consumo
Provette coniche (15 mL)	Plastiche Olympus	28-101
Provette coniche (50 mL)	Plastiche Olympus	28-106
Provette di coltura con tappo del flusso d'aria	Plastiche Olympus	21-129
Piatto a quattro camere da 35 mm con fondo in vetro	CellVis	NC0600518
Brodo Luria-Bertani (LB)	Genessee Scientific	11-118
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Fisher Bioreagenti	BP2944100
Punte di pipette (p200)	Plastiche Olympus	23-150RL
Punte di pipette (p1000)	Plastiche Olympus	23-165RL
Pipette sierologiche (5 mL)	Plastiche Olympus	12-102
Pipette sierologiche (25 mL)	Plastiche Olympus	12-106
Pipette sierologiche (50 mL)	Plastiche Olympus	12-107
Acqua ultrapura (senza RNAsi/DNAsi); acqua nanopura	Genessee Scientific	18-194	Acqua nanopura utilizzata per la preparazione di soluzioni nella Tabella 1
Siringhe (10 mL)	Bd	794412
Siringhe (50 mL)	Bd	309653
Filtro per siringa in PES da 0,22 mm	Plastiche Olympus	25-244
Cuvetta PS semi-mico	Plastiche Olympus	91-408
software
Biorender			Per preparare le figure
FacsDiva6.1.3	Becton Dickinson, San Jose, CA
Imaris	Piano bit		Versione 9.6
Zen Nero
attrezzatura
FacsAriallu	Becton Dickinson, San Jose, CA
Microscopio confocale a scansione laser LSM 880	Zeiss