1. Preparare il terreno sintetico per la fibrosi cistica (SCFM2)
NOTA: La preparazione di SCFM2 comprende tre fasi principali descritte di seguito (Figura 1).
- Sterilizzazione della mucina suina
- Preparare mucina sterile a una concentrazione finale di 5 mg/mL in SCFM2. Ad esempio, per un volume di 5 ml di SCFM2, pesare 25 mg di mucina di tipo II in una piastra di Petri sterile e immergerla in uno sterilizzatore a raggi ultravioletti (UV) per 4 ore, agitando delicatamente ogni ora.
- Dopo 4 ore, trasferire la mucina trattata con raggi UV in provette autoclavate da 1,7 mL in condizioni sterili e conservare a -20 °C.
- Per confermare la sterilizzazione completa, sciogliere un campione di mucina in un liquido sterile, come acqua o brodo Luria-Bertani (LB), e osservare al microscopio.
nota: La mucina sterilizzata può essere conservata a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
- Preparazione della base tamponata
- Preparare le soluzioni madre di sale e aminoacidi aggiungendo le quantità appropriate in peso all'acqua deionizzata come elencato nella Tabella 1. Sterilizzare con filtro tutte le soluzioni madre utilizzando un filtro da 0,22 μm, avvolgerle in un foglio per proteggerle dalla degradazione della luce e conservarle a 4 °C per un massimo di un mese.
- Preparare la base tamponata combinando 190 ml di acqua deionizzata con soluzioni di amminoacidi e sale nei volumi elencati nella Tabella 1. Regolare la soluzione a pH 6,8 e aumentare fino a un volume finale di 250 ml. Sterilizzare con un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C per un massimo di 30 giorni.
- La sera prima dell'esperimento, aliquotare la quantità desiderata di base tamponata in un pallone di coltura di vetro e aggiungere mucina (5 mg/mL come descritto al punto 1.1.1) e DNA di sperma di salmone purificato (0,6 mg/mL). Agitare delicatamente, avvolgere in un foglio e lasciare a 4 °C per una notte per consentire alla mucina e al DNA di dissolversi in soluzione.
nota: Le aliquote di DNA dello sperma di salmone devono essere scongelate con ghiaccio, vortex e aggiunte alla base tamponata e alla mucina. Le soluzioni madre di triptofano, asparagina e tirosina devono essere preparate in soluzioni di NaOH (vedere la Tabella 1 per le concentrazioni) invece che in acqua deionizzata. Conservare la base tamponata e tutte le soluzioni stock avvolte in un foglio di alluminio per proteggerle dall'esposizione alla luce. La maggior parte delle azioni sarà stabile per un massimo di un mese. I calci che si scoloriscono non devono essere utilizzati e devono essere sostituiti prima dell'uso.
- Aggiunta di scorte supplementari
- Il giorno dell'esperimento, aggiungere i ceppi elencati nella tabella 2 alla base tamponata contenente mucina e DNA.
nota: Preparare una soluzione fresca di FeSO4 il giorno dell'esperimento, ma tutte le altre scorte possono essere preparate in anticipo e conservate per 30 giorni a 4 °C. L'1,2-dietoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) contiene cloroformio. Maneggiare con cautela e non utilizzare vicino a fiamme libere. Dopo l'aggiunta di DOPC, incubare SCFM2 a 37 °C agitando (250 giri/min) per almeno 20 minuti (per colture da 5 mL). Questo periodo di incubazione consente al cloroformio nel DOPC di evaporare. Il pallone non deve essere ermetico; Invece, copri l'apertura del pallone senza stringere con un foglio.
2. Valutazione in tempo reale della tolleranza antimicrobica negli aggregati batterici
- Preparare le colture durante la notte
- La sera prima dell'esperimento, inoculare 5 ml di brodo LB con diverse colonie di Pa PAO1-pMRP9-113 da una piastra di agar LB contenente antibiotico (carbenicillina 300 μg/mL). Crescere durante la notte a 37 °C con agitazione a 250 giri/min.
nota: Coltivare colture notturne con l'aggiunta di antibiotici necessari per la selezione dei plasmidi necessari (qui, il plasmide di espressione della proteina fluorescente verde (GFP), pMRP9-1). Si noti che le cellule di Pa devono essere lavate prima dell'inoculazione di SCFM2. LB può essere sostituito con altri ricchi terreni di laboratorio per colture notturne. Tutti gli isolati batterici devono essere gestiti utilizzando le linee guida BSL-2 appropriate in tutto questo protocollo.
- Inoculare SCFM2
- Il giorno dell'esperimento, diluire le colture notturne di Pa 1:10 (coltura: terreno liquido) inoculando 500 μL in 5 mL di brodo LB fresco. Far crescere le cellule fino alla fase logaritmica (60-90 min) a 37 °C con agitazione a 250 giri/min.
- Centrifugare le colture in fase log a 10.000 × g per 5 minuti. Lavare le cellule rimuovendo il surnatante e risospendendole in 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato sterilizzata con filtro (PBS, pH 7,0). Ripetere due volte e risospendere il pellet in un volume finale di 1 mL di PBS.
- Misurare l'assorbanza delle cellule lavate utilizzando uno spettrofotometro a 600 nm (OD600) e calcolare il volume di coltura richiesto per un OD600 iniziale di 0,05 in 5 mL di SCFM2. Inoculare Pa nell'SCFM2 e agitare delicatamente per distribuire le cellule dappertutto. Pipettare 1 mL di SCFM2 inoculato in ciascuna camera di un piatto ottico a 4 pozzetti, fondo in vetro, e incubare per 4 ore staticamente a 37 °C.
nota: Il tempo di raddoppio delle colture di Pa dipende dal ceppo e dalla disponibilità di ossigeno. In SCFM2, nelle condizioni qui descritte, il tempo di raddoppio di Pa è ~1.4 h.
3. Visualizzazione degli aggregati durante il trattamento antibiotico con microscopia confocale a scansione laser (CLSM)
NOTA: Questa sezione descrive l'uso del microscopio a scansione laser confocale e del software di acquisizione delle immagini per l'imaging di aggregati di Pa in SCFM2. L'obiettivo è quello di osservare e caratterizzare la biomassa batterica rimanente (tollerante) dopo il trattamento con antibiotici. I passaggi descritti possono essere eseguiti con successo su altri microscopi confocali, anche se è necessario fare riferimento al manuale operativo dello strumento per una guida specifica.
- Immagini di colture di Pa utilizzando una camera riscaldata o una micropiastra riscaldata montata sul tavolino del microscopio per mantenere una temperatura ambiente di 37 °C. Avviare il modulo di incubazione almeno 2 ore prima dell'inizio dell'esperimento per consentire a tutti gli apparecchi di raggiungere la temperatura desiderata e ridurre ulteriormente l'espansione e il movimento durante la raccolta dei dati.
- Dopo 4 ore, trasferire le colture SCFM2 contenenti cellule Pa al microscopio riscaldato. Designare 3 pozzetti su 4 come repliche tecniche per il trattamento antibiotico e considerare il quarto pozzetto come un controllo senza trattamento, contenente solo cellule Pa in SCFM2, senza antibiotici. Identificare gli aggregati utilizzando la microscopia a campo chiaro all'interno della scheda Localizza prima di qualsiasi eccitazione dei reporter fluorescenti. Definisci un'area per l'imaging all'interno di ciascun pozzetto e memorizza la sua posizione (coordinate x-y-z) utilizzando il modulo Posizioni nel software di imaging.
- Utilizzare un obiettivo a immersione in olio 63x per visualizzare colture di Pa contenenti il plasmide di espressione GFP pMRP9-1 in SCFM2 con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 509 nm. Scatta immagini utilizzando l'opzione z-stack all'interno del modulo di acquisizione a intervalli di 1 μm (totale di 60 sezioni). Utilizzare il modulo Line-averaging per ridurre la fluorescenza di fondo nel canale GFP entro il volume totale delle immagini z-stack da 60 μm (1.093,5 mm3). Acquisisci immagini di controllo di SCFM2 non inoculato utilizzando impostazioni identiche per determinare la fluorescenza di fondo per l'analisi delle immagini.
nota: Le immagini vengono acquisite producendo immagini z-stack a 8 bit da 512 pixel x 512 pixel (0,26 μm x 0,26 μm pixel) che si trovano a 60 μm dalla base del vetrino coprioggetti.
- Utilizzare l'opzione serie temporale all'interno del software di imaging per acquisire 60 fette in ogni posizione (pozzetto) a intervalli di 15 minuti per un periodo di 18 ore. Utilizzare la strategia di messa a fuoco definita all'interno del software per memorizzare un piano focale per ogni posizione, che viene restituito in ogni punto temporale durante l'esperimento.
- Dopo un totale di 4,5 ore di incubazione, visualizzare ogni posizione utilizzando le impostazioni di cui sopra per determinare la biomassa aggregata all'interno di ciascuno dei quattro pozzetti prima dell'aggiunta di antibiotico.
- Dopo 6 ore di incubazione totale, aggiungere antibiotico a una concentrazione inibitoria minima (MIC) 2x-inferiore a ciascuna replica. Pipettare direttamente e delicatamente al centro del pozzetto, appena sotto l'interfase aria-liquido. Mantenere tutte le colture nella camera confocale riscaldata.
nota: In questo caso, è stata utilizzata colistina solfato a una concentrazione di 140 μg/mL.
- Inizia l'imaging post-trattamento antibiotico facendo clic sull'opzione Inizia esperimento all'interno del programma di imaging.
nota: La concentrazione di antibiotico utilizzata dipende dall'antibiotico, dall'isolato di Pa e dal fatto che l'utente desideri esaminare gli effetti di uccisione o di tolleranza. Questo esperimento utilizza una singola dose. Se necessario, è possibile aggiungere dosi aggiuntive senza interrompere le colture.
4. Colorazione con ioduro di propidio di aggregati di Pa
NOTA: Lo ioduro di propidio (PI) è comunemente utilizzato come reagente di colorazione per identificare le cellule batteriche non vitali (morte) in coltura. Qui, viene utilizzato per identificare gli aggregati sensibili al trattamento antibiotico applicato nella sezione 3. In questo protocollo, l'espressione e la rilevazione della GFP nelle cellule Pa viene utilizzata come principale proxy per la vitalità cellulare. Questo passaggio finale consente di utilizzare ancora una volta l'imaging confocale per identificare il posizionamento spaziale di aggregati vivi/morti in relazione l'uno all'altro. Inoltre, gli aggregati sono identificati come vivi/morti per l'ulteriore smistamento delle cellule a valle nella sezione 3.
- Dopo 18 ore, aggiungere PI a ciascun pozzetto del piatto ottico inferiore a quattro camere contenente colture SCFM2. Seguire le istruzioni del produttore per il volume di PI e il tempo di incubazione (ad esempio, ~2 μL per mL di coltura, ~20-30 min).
5. Isolamento di cellule vive da aggregati utilizzando un approccio di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS)
NOTA: FACS presenta una potente piattaforma per ordinare e isolare gruppi di cellule in base a un fenotipo marcato in modo fluorescente. In questo caso, il FACS viene utilizzato per isolare aggregati vivi (tolleranti agli antibiotici) da aggregati non vitali.
- Dopo la colorazione con ioduro di propidio, rimuovere le colture dall'incubazione e trasferirle in uno strumento FACS in un contenitore isolato per mantenere i 37 °C.
- Eseguire aliquote da 1 mL di SCFM2 contenente aggregati Pa alla velocità di flusso più bassa.
nota: Ogni aliquota conterrà ~15.000 aggregati.
- Per rilevare la GFP, illuminare le celle con un laser a 488 nm e registrare l'altezza del segnale fluorescente a 530/30 nm. Visualizzare la colorazione PI mediante eccitazione con un laser a 561 nm e registrare l'altezza del segnale fluorescente a 610/20 nm. Eseguire lo smistamento utilizzando un ugello 70-u.
nota: Gli aggregati ordinati possono essere raggruppati in più modi a seconda dell'applicazione dell'utente. In questo caso, il FACS è stato utilizzato per selezionare aggregati di Pa vitali per il sequenziamento dell'RNA a valle.
Tabella 1: Preparazione delle scorte di sale, amminoacidi, DNA e mucina necessarie per la base tamponata del terreno sintetico di espettorato per fibrosi cistica, SCFM2.
| chimico | Concentrazione delle scorte (m) | Concentrazione finale (mM) | Note |
| NaH2PO4 | 0,2 | 1.3 | |
| Na2HPO4 | 0,2 | 1.25 | |
| KNO3 | 1 | 0,35 | |
| K2SO4 | 0,25 | 0,27 | |
| NH4Cl | | 2.28 | Aggiungi solido direttamente alla base bufferizzata |
| Kcl | | Ore 14.94 | Aggiungi solido direttamente alla base bufferizzata |
| NaCl | | 51,85 | Aggiungi solido direttamente alla base bufferizzata |
| Mops | | 10 | Aggiungi solido direttamente alla base bufferizzata |
| Ser | 0,1 | 1.45 | |
| Glu HCl | 0,1 | 1,55 | |
| pro | 0,1 | 1.66 | |
| Gly | 0,1 | 1.2 | |
| Ala | 0,1 | 1.78 | |
| Val | 0,1 | 1.12 | |
| Incontrato | 0,1 | 0,63 | |
| ile | 0,1 | 1.12 | |
| leu | 0,1 | 1.61 | |
| Orn HCl | 0,1 | 0,68 | |
| Lys HCl | 0,1 | 2.13 | |
| Arg HCl | 0,1 | 0,31 | |
| Trp | 0,1 | 0,01 | Preparato in 0,2 m di NaOH |
| aspide | 0,1 | 0,83 | Preparato in 0,5 m di NaOH |
| Tyr | 0,1 | 0,8 | Preparato in 1,0 m NaOH |
| Thr | 0,1 | 1,07 | |
| Cys HCl | 0,1 | 0,16 | |
| Phe | 0,1 | 0,53 | |
| Il suo HCl H2O | 0,1 | 0,52 | |
| DNA spermatico di salmone | | 0,6 mg/mL | |
| Mucina suina | | 5 mg/nL | |
Tabella 2: Preparazione di ceppi aggiuntivi necessari per la base tamponata del terreno sintetico per espettorato di fibrosi cistica, SCFM2.
| chimico | Concentrazione delle scorte (M) | Concentrazione finale (mM) | Note |
| Destrosio (D-glu2cose) | 1 | 3 | |
| Acido L-lattico | 1 | 9.3 | Regolazione a pH 7,0 con NaOH |
| CaCl2*H2O | 1 | 1.75 | |
| MgCl2*6H2O | 1 | 0,61 | |
| FeSO4*7H2O | 1 mg/mL | 0,0036 | Prepara prodotti freschi ogni giorno |
| N-acetilglucosamina | 0,25 | 0,3 | |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) | 25 mg/mL | 100 μg/mL | Incubare per almeno 20 minuti a 37 °C dopo l'aggiunta |
