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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparare le cellule per l'infezione
- Propagare la linea cellulare macrofagica di topo RAW 264.7 in terreni di coltura tissutale DMEM integrati con il 10% di siero fetale di vitello (d'ora in poi denominato DMEM/FCS) utilizzando un pallone da 125 ml e un incubatore per colture tissutali mantenuto a 37 °C/5% CO2.
- Il giorno prima dell'infezione, utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere le cellule dal pallone di espansione e raccoglierle in una provetta conica con tappo a vite da 15 mL. Centrifugare le cellule a 800 x g per 10 minuti, decantare il surnatante, sospendere il pellet cellulare in 1 mL di DMEM/FCS (senza antibiotici) e determinare il titolo utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
- Regolare il titolo a 2 x 106 cellule/mL e aggiungere 0,10 mL (2 x 105 cellule) ai pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti. Assicurarsi che la sospensione cellulare copra l'intera superficie del pozzo.
- Piastre di cellule in pozzetti aggiuntivi per una successiva fonte di mezzi condizionati. Inoltre, posizionare 0,10 mL di DMEM/FCS in tre pozzetti aggiuntivi per fungere da "controllo senza cellule".
- Incubare per una notte in un incubatore per colture tissutali a 37 °C/5% CO2. Il giorno successivo, non rimuovere dall'incubatrice fino a quando l'inoculo del batterio non è preparato e pronto per l'uso.
2. Preparazione di Listeria monocytogenes (Lm) per l'infezione
- Inoculare 2 mL di infusione cervello-cuore (BHI) con una singola colonia da una piastra di agar appena striata (<2 giorni) di Lm e incubare per una notte a 37 °C con agitazione a 130 rotazioni/min.
- Il giorno successivo, aggiungere 0,10 mL di coltura notturna a 2 mL di BHI pre-riscaldato e continuare l'incubazione a 37 °C con agitazione fino a quando la densità ottica (OD600) è compresa tra 0,4 e 0,6.
- Determinare il titolo batterico approssimativo utilizzando una formula di conversione derivata empiricamente. Nel nostro laboratorio, una coltura di Lm in crescita esponenziale in BHI è di circa 1,3 x 109 unità formanti colonie (CFU)/OD600. Ridurre al minimo la quantità di tempo in cui le colture batteriche sono esposte a temperatura ambiente.
- Poco prima dell'infezione, regolare il titolo a 5 x 107 CFU/mL utilizzando DMEM/FCS preriscaldato come diluente.
3. Infezione
- Lavorando in modo rapido e preciso, aggiungere 20 μL (1 x 106 CFU; molteplicità di infezione, MOI = 5) dell'inoculo Lm appena preparato (passaggio 2.4 sopra) ai pozzetti inclinando leggermente la capsula e posizionando con cura la punta della pipetta nel terreno sovrastante;
NOTA: Evitare di toccare le pareti del pozzetto con la punta della pipetta.
- Pipettare delicatamente il contenuto di ciascun pozzetto per garantire una miscelazione completa; non agitare o inclinare significativamente la piastra poiché ciò diffonderà Lm sulle pareti del pozzetto. Rimettere la piastra di coltura cellulare in un incubatore a 37 °C/5% CO2
.
- Preparare una soluzione di gentamicina da 10 μg/mL utilizzando come diluente terreni condizionati provenienti da pozzetti non infetti.
- A 30 minuti dall'infezione (mpi), aggiungere con cautela 30 μL della soluzione di gentamicina (concentrazione finale 2,5 μg/mL) e pipettare delicatamente il contenuto del pozzetto come prima e riportare la piastra di coltura cellulare all'incubatore a 37 °C/5% CO2
.
- A 60 mpi, raccogliere pozzetti appropriati per il saggio CFU (punto temporale di 60 mpi) o per l'analisi FCM (come descritto di seguito nelle sezioni 4 e 5, rispettivamente).
- Per i pozzetti rimanenti, in seguito in vari momenti prelevare le cellule come prima o, per il saggio di emergenza Lm, rimuovere completamente il terreno dal pozzetto e sostituirlo con 150 μL di terreno condizionato privo di gentamicina.
4. Elaborazione del campionamento e analisi di Lm intracellulare ed emergente mediante saggio CFU
- Per raccogliere, inclinare leggermente il piatto e rimuovere con cura l'intero supporto dal pozzo. Aggiungere 0,50 ml di acqua sterile distillata (dsH2O) al pozzetto. Dopo 30 s, trasferire il lisato d'acqua risultante (100) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e agitare energicamente per 10 s.
- Preparare 10-1 e 10-2 diluizioni aggiungendo 4,5 μl o 50 μl di lisato d'acqua a 450 μl di dsH2O e agitare brevemente per garantire una miscelazione accurata.
- Distribuire 50 μl dei campioni 10,0, 10-1 e/o 10-2 su piastre di agar con brodo di lisogenesi (LB).
- Per il saggio di Lm emergente (passaggio 3.6 sopra), rimuovere 10 μL del terreno di sovrapposizione e dividerlo in due aliquote da 5 μL: a un'aliquota aggiungere 5 μL di DMEM/FCS e alla seconda aliquota aggiungere 5 μL di DMEM/FCS contenente 5 μg/mL di gentamicina. Quest'ultimo controllo distingue tra Lm extracellulare (sensibile alla gentamicina) e Lm intracellulare (resistente alla gentamicina) nel successivo test di CFU.
- Dopo 5 minuti a temperatura ambiente, aggiungere 90 μL di dsH2O, agitare energicamente per 10 s e distribuire 50 μL su piastre di agar LB.
- Enumerare le colonie di Lm su piastre di agar LB dopo 2 giorni di incubazione a 37 °C.