Analisi con Citometria a Flusso di Listeria monocytogenes intracellulare ed extracellulare emergente in vitro

Abstract

Fonte: Gayle, P. et al., Utilizzo di un patogeno batterico per sondare le risposte dell'ospite a livello cellulare e organismico. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, quantifichiamo la Listeria monocytogenes intracellulare ed extracellulare, un batterio patogeno intracellulare, in seguito alla loro infezione di macrofagi in coltura in vitro utilizzando la citometria a flusso.

Protocollo

1. Campionamento, elaborazione e analisi di Lm intracellulare ed emergente mediante citometria a flusso (FCM)

1. Preparare la linea cellulare macrofagica di topo RAW 264.7 in terreno di coltura tissutale DMEM integrato con il 10% di siero fetale di vitello (d'ora in poi denominato DMEM/FCS) utilizzando un pallone da 125 ml e un incubatore per colture tissutali mantenuto a 37 °C/5% CO₂. Regolare le cellule a 1 x 10⁶ cellule/mL e aggiungere 1 mL (1 x 10⁶ cellule) ai pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti.
2. Preparare Listeria monocytogenes, Lm, inoculo batterico e infettare le cellule con il volume di inoculo corrispondente a un MOI di 50 (5 x 10⁷ CFU).
3. A 1,5 ore dall'infezione (hpi), raccogliere i terreni dalla prima serie di pozzetti e metterli in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml con 500 μl di paraformaldeide al 4% (PFA) e metterli in ghiaccio fino a quando tutti i pozzetti non sono stati processati.
4. Per raccogliere l'Lm intracellulare, aggiungere 1 mL di ds H₂O al pozzetto e dopo 60 s, trasferire il lisato d'acqua risultante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL con 500 μL di PFA al 4%. Agitare energicamente per 10 secondi e mettere sul ghiaccio fino a quando tutti i pozzetti sono stati lavorati.
5. Per i pozzetti rimanenti, rimuovere il terreno e sostituirlo con 1 mL di DMEM/FCS con 5 μg/mL di gentamicina per uccidere la Lm extracellulare e riportare prontamente le cellule nell'incubatore.
6. Dopo 30 minuti (2 hpi) rimuovere il terreno e sostituirlo con DMEM/FCS senza gentamicina.
7. Dopo 2 e 4 ore (4 e 6 hpi) prendere il secondo e il terzo tempo raccogliendo terreni e lisati.
8. Centrifugare le provette a 10.000 x g per 7 min. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet.
9. Sospendere ogni pellet in un cocktail colorante di 50 μl di PFA al 4% e 15 μl di falloidina. Incubare le provette al buio a 4 °C per 20 minuti.
10. Dopo l'incubazione, aggiungere 1 mL di tampone FACS a ciascuna provetta e pipettare su e giù per miscelare.
11. Centrifugare i tubi a 10.000 x g per 7 min. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet.
12. Sospendi ogni pellet in 400 μl di tampone FACS per l'uso immediato, o 200 μl di tampone FACS e 200 μl di PFA al 4% se conservato per un'analisi successiva.
13. Eseguire i campioni sulla citometria a flusso e analizzare i dati raccolti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Brodo BHI (Brain Heart Infusion)	EMD Milipore	110493
Filtro cellulare, 70 μm	VWR	Codice 10199-656
Collagenasi D	Roche	11088858001
Supporti DMEM	Gibco	Codice 11965-092
Tubi FACS	Falco BD	352054
FBS - Inattivato a caldo	Sigma-Aldrich	F4135-500ML
Soluzione salina bilanciata di Hanks	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
LB agar	Cellule di crescita MS	MBPE-4040
LIVE/DEAD Kit di colorazione gialla per cellule morte fissabile	Tecnologie per la vita	L349S9
Falloidina di rodamina	Thermo Fischer	R415
Analizzatore spettrale SP6800	Sony
Piastre a 48 pozzetti per colture tissutali TPP	MIDSCI	TP92048
Piastre a 6 pozzetti per colture tissutali TPP	MIDSCI	TP92406