1. Raccogli e prepara le mosche
- Posteriore Drosophila melanogaster nelle condizioni sperimentali desiderate. Fare attenzione a non sovraffollare le mosche durante l'allevamento e assicurarsi che le densità larvali siano coerenti tra i trattamenti, poiché le condizioni ambientali durante lo stadio larvale possono influenzare profondamente i fenotipi delle difese immunitarie durante lo stadio adulto.
- Raccogliere le mosche sperimentali 0 - 3 giorni dopo l'eclosione dall'involucro pupale e trasferirle su un terreno fresco.
- Alloggiare le mosche raccolte alla temperatura desiderata (le temperature comprese tra 22 °C e 28 °C sono generalmente adatte) fino a quando non hanno un'età di 5 - 7 giorni dopo l'eclosione.
nota: Ciò consente alle mosche di completare la metamorfosi e diventare adulti maturi, ma è molto prima che inizi la senescenza.
- Ordina il numero desiderato di mosche in una fiala separata prima dell'infezione, facendo attenzione a evitare il sovraffollamento.
nota: Solo i maschi sono infettati in questa dimostrazione, ma è ugualmente possibile infettare le femmine utilizzando la procedura descritta.
2. Coltura e preparazione dei batteri
- Preparare una piastra master dei batteri scelti almeno 2 giorni prima dell'infezione. Estrarre i batteri da una scorta di glicerolo al 15% conservata a tempo indeterminato a -80 °C. Conservare la piastra madre a 4 °C per un massimo di 2 settimane. Striare sempre le piastre master direttamente dal brodo di glicerolo congelato. Evitare il passaggio seriale di batteri da una piastra all'altra, poiché il passaggio ripetuto in coltura può causare lo sviluppo di una virulenza attenuata dei batteri.
nota: Questo esempio fa uso di Providencia rettgeri ed Escherichia coli.
- Utilizzare la seguente procedura per preparare una sospensione batterica per preparazioni iniettabili.
- Coltiva una coltura batterica da 2 ml inoculando un terreno sterile con una singola colonia isolata dalla piastra master. Far crescere i batteri fino alla fase stazionaria (ad es. crescita O/N a 37 °C).
nota: Sia il P. rettgeri che l'E. coli crescono bene nel brodo di Luria a temperature comprese tra 20 e 37 °C con un leggero agitamento.
- Una volta che la coltura ha raggiunto la fase stazionaria, pellettare delicatamente le cellule da circa 600 μl di coltura in una centrifuga da tavolo (3 min a 5.000 x g), scartare il surnatante e risospendere i batteri in circa 1.000 μl di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS; 137 mM di cloruro di sodio, NaCl, 2,7 mM di cloruro di potassio, KCl, 10 mM di fosfato di sodio, Na2PO4, 1,8 mM di fosfato monobasico di potassio, KH2PO4, pH = 7,4).
- Diluire le cellule risospese in PBS sterile per ottenere una densità ottica (OD) appropriata per il batterio utilizzato, misurata con uno spettrofotometro come l'assorbanza a 600 nm. Usa questa sospensione per infettare le mosche.
nota: A600 = 0,1 o 1,0 corrisponde rispettivamente a circa 108 e 109 Providencia rettgeri o E. coli per ml. Poiché sia i batteri vivi che quelli morti contribuiscono alla densità ottica, è importante raccogliere le colture all'inizio della fase stazionaria prima che i cadaveri batterici si accumulino e distorcano la relazione tra la densità ottica e il numero di batteri vitali introdotti durante l'infezione.
3. Infetta le mosche
NOTA: Poiché l'immunità alla Drosophila è influenzata dal ritmo circadiano, è importante eseguire infezioni in un momento della giornata simile in tutte le repliche sperimentali.
- Utilizzo di un nanoiniettore
- Prepara gli aghi di vetro per l'infezione.
- Preparare un ago di vetro tirando un capillare di vetro borosilicato utilizzando un estrattore per micropipette.
- Utilizzando una pinza, rompere la punta dell'ago per creare un'apertura di circa 50 μm di diametro per consentire l'espulsione del liquido.
- Montare l'iniettore.
- Posizionare l'O-ring di tenuta e poi il distanziatore bianco (grande fossetta rivolta verso l'esterno) sullo stantuffo metallico.
- Riempire l'ago di vetro con olio minerale utilizzando una siringa con un ago da 30 G.
- Inserire l'ago di vetro riempito attraverso la pinza e quindi posizionare l'O-ring più grande attorno alla sua base, a circa 1 mm dall'estremità smussata dell'ago.
- Far scorrere l'ago sullo stantuffo di metallo e avvitare delicatamente la pinza fino a fissarla.
- Espellere la maggior parte dell'olio minerale dall'iniettore, ma assicurarsi che ci sia ancora un piccolo volume di olio nell'ago che funga da barriera tra l'iniettore e la sospensione batterica. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria all'interno dell'olio minerale o della sospensione batterica, o tra i due liquidi.
- Impostare l'iniettore sul volume desiderato per l'iniezione (tra 9 nl e 50 nl).
- Genera controlli sulle ferite.
- Riempire l'ago dell'iniettore con PBS sterile inserendo con cautela la punta dell'ago capillare in un tubo del fluido e premendo il pulsante "riempimento" sull'iniettore.
nota: I terreni di crescita batterici sterili possono anche essere utilizzati come controllo delle ferite se l'esperimento richiede l'iniezione di batteri sospesi nel loro mezzo di crescita. Tuttavia, poiché i terreni di crescita batterici contengono componenti che possono stimolare il sistema immunitario o avere altri effetti sull'ospite, è preferibile un vettore inerte come la PBS.
- Anestetizzare il numero desiderato di mosche sotto un leggero flusso di anidride carbonica (CO2 ).
- Iniettare le mosche nell'addome anteriore sulla superficie ventrolaterale con il PBS sterile.
nota: È anche possibile iniettare mosche in altri siti, come la placca sternopleurica del torace, ma è importante mantenere il sito di iniezione coerente all'interno di ogni esperimento.
- Mettere le mosche iniettate in fiale fresche con un nuovo mezzo, posando le fiale su un lato fino a quando tutte le mosche si sono riprese dall'anestesia per evitare che le mosche si attacchino al cibo.
nota: Si raccomanda di iniettare i moscerini di controllo PBS prima di iniettare batteri nei moscerini sperimentali in modo che lo stesso ago possa essere utilizzato per entrambi i trattamenti. Non sarà sempre possibile utilizzare lo stesso ago per un intero esperimento. In tal caso, potrebbe essere desiderabile registrare quale ago è stato utilizzato con quali mosche e includere l'identità dell'ago come fattore sperimentale nell'analisi statistica.
- Iniettare l'agente patogeno batterico.
- Espellere il terreno sterile rimanente dall'iniettore e riempire lo stesso ago con la sospensione batterica.
- Ripetere la procedura di cui sopra (3.1.3), iniettando ora nei moscerini la sospensione batterica preparata nella procedura 2.2.
