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1. Raccogli e prepara le mosche
- Posteriore D. melanogaster nelle condizioni sperimentali desiderate. Fare attenzione a non sovraffollare le mosche durante l'allevamento e assicurarsi che le densità larvali siano coerenti tra i trattamenti, poiché le condizioni ambientali durante lo stadio larvale possono influenzare profondamente i fenotipi delle difese immunitarie durante lo stadio adulto.
- Raccogliere le mosche sperimentali 0 - 3 giorni dopo l'eclosione dall'involucro pupale e trasferirle su un terreno fresco.
- Alloggiare le mosche raccolte alla temperatura desiderata (le temperature comprese tra 22 °C e 28 °C sono generalmente adatte) fino a quando non hanno un'età di 5 - 7 giorni dopo l'eclosione.
nota: Ciò consente alle mosche di completare la metamorfosi e diventare adulti maturi, ma è molto prima che inizi la senescenza.
- Ordina il numero desiderato di mosche in una fiala separata prima dell'infezione, facendo attenzione a evitare il sovraffollamento.
nota: Solo i maschi sono infettati in questa dimostrazione, ma è ugualmente possibile infettare le femmine utilizzando la procedura descritta.
2. Coltura e preparazione dei batteri
- Preparare una piastra master dei batteri scelti almeno 2 giorni prima dell'infezione. Estrarre i batteri da una scorta di glicerolo al 15% conservata a tempo indeterminato a -80 °C. Conservare la piastra madre a 4 °C per un massimo di 2 settimane. Striare sempre le piastre master direttamente dal brodo di glicerolo congelato. Evitare il passaggio seriale di batteri da una piastra all'altra, poiché il passaggio ripetuto in coltura può causare lo sviluppo di una virulenza attenuata dei batteri.
nota: Questo esempio fa uso di Providencia rettgeri ed Escherichia coli.
- Utilizzare la seguente procedura per preparare una sospensione batterica per preparazioni iniettabili.
- Coltiva una coltura batterica da 2 ml inoculando un terreno sterile con una singola colonia isolata dalla piastra master. Far crescere i batteri fino alla fase stazionaria (ad es. crescita O/N a 37 °C).
nota: Sia il P. rettgeri che l'E. coli crescono bene nel brodo di Luria a temperature comprese tra 20 e 37 °C con un leggero agitamento.
- Una volta che la coltura ha raggiunto la fase stazionaria, pellettare delicatamente le cellule da circa 600 μl di coltura in una centrifuga da tavolo (3 min a 5.000 x g), scartare il surnatante e risospendere i batteri in circa 1.000 μl di soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4, pH = 7,4).
- Diluire le cellule risospese in PBS sterile per ottenere una densità ottica (OD) appropriata per il batterio utilizzato, misurata con uno spettrofotometro come l'assorbanza a 600 nm. Usa questa sospensione per infettare le mosche.
nota: A600 = 0,1 o 1,0 corrisponde rispettivamente a circa 108 e 109 Providencia rettgeri o E. coli per ml. Poiché sia i batteri vivi che quelli morti contribuiscono alla densità ottica, è importante raccogliere le colture all'inizio della fase stazionaria prima che i cadaveri batterici si accumulino e distorcano la relazione tra la densità ottica e il numero di batteri vitali introdotti durante l'infezione.
3. Infetta le mosche
NOTA: Poiché l'immunità alla Drosophila è influenzata dal ritmo circadiano, è importante eseguire infezioni in un momento della giornata simile in tutte le repliche sperimentali.
- con puntura di spillo settica
- Preparare l'ago per la puntura.
- Fondere l'estremità di un puntale per micropipetta da 200 μl e inserire uno spillo per insetti da 0,15 mm nella plastica fusa. Lasciare solidificare la plastica in modo tale che il perno sia tenuto in posizione con circa 0,5 cm di perno che si estende dalla plastica.
- Genera controlli sulle ferite.
- Anestetizzare il numero desiderato di mosche sotto un flusso leggero di CO2.
- Pungere le mosche nella placca sternopleurica del torace con l'ago, evitando i siti di attacco delle ali e delle zampe. Se necessario, rimuovere delicatamente le mosche dal perno dei minuti utilizzando una pinza morbida.
nota: È anche possibile pungere le mosche in altri siti, come l'addome anteriore sulla superficie ventrolaterale, ma è importante mantenere il sito di iniezione coerente all'interno di ogni esperimento. Pungere attraverso la cuticola dell'addome tende ad essere più difficile che pungere il torace ed è quindi meno comune.
- Metti le mosche pungenti in una fiala fresca con un nuovo mezzo per mosche, posando la fiala su un lato fino a quando tutte le mosche si sono riprese dall'anestesia per evitare che le mosche si attacchino al cibo.
- Introdurre l'infezione batterica.
- Anestetizzare il numero desiderato di mosche sotto un flusso leggero di CO2.
- Pungere ogni mosca nella stessa posizione dei controlli del supporto, immergendo la punta del perno nella sospensione batterica preparata nella procedura 2.2 prima di pungere ogni mosca.
- Metti le mosche pungenti in una fiala fresca con un nuovo mezzo per mosche, posando la fiala su un lato fino a quando tutte le mosche si sono riprese dall'anestesia per evitare che le mosche si attacchino al cibo.