Misurazione della carica batterica di E. coli in Drosophila melanogaster a seguito di infezione da E. coli

Abstract

Fonte: Khalil, S., et al. Infezione batterica sistemica e fenotipi di difesa immunitaria in Drosophila melanogaster. (2015)

In questo video, dimostriamo una tecnica per misurare la carica batterica di E. coli dopo aver iniettato E. coli nel torace di Drosophila melanogaster.

Protocollo

1. Saggio della carica batterica post-infezione

1. Misurare la carica batterica.
   1. A un orario prescritto dopo l'iniezione, mettere ogni mosca in una provetta da microcentrifuga con ghiaccio.
   2. Aggiungere 250 μl di PBS a ciascuna provetta e omogeneizzare le mosche utilizzando un pestello o un frusta per sfere.
   3. Piastra l'omogeneizzato su una piastra di agar LB, utilizzando un piatto a spirale o una diluizione seriale.
      1. Per la piastra utilizzando la diluizione seriale, trasferire ciascun omogeneizzato di mosca nella prima fila di una piastra a 96 pozzetti.
      2. Riempire ogni pozzetto delle file rimanenti con 90 μl di PBS.
      3. Utilizzando una pipetta multicanale, prelevare 10 μl dalla prima fila contenente l'omogeneizzato di mosca e dosare nella seconda fila.
      4. Pipettare su e giù almeno 10 volte per mescolare accuratamente, quindi prelevare 10 μl e trasferire alla terza fila. Ripetere questa procedura utilizzando le righe rimanenti.
      5. Partendo dalla fila inferiore (la maggior parte delle sospensioni batteriche diluite), utilizzare la pipetta multicanale per prelevare 10 μl da ciascun pozzetto e depositare su una piastra LB, facendo attenzione che i campioni vengano dispensati come punti discreti che non si toccano. Ripetere fino a quando tutti i pozzetti sono stati campionati da ogni fila, erogandoli in ordine decrescente di diluizione sulla piastra LB.
      6. Lasciare la piastra in RT fino a quando le macchie non si sono completamente immerse nella piastra LB.
         nota: Si consiglia di asciugare la piastra LB per alcuni giorni a RT prima dell'uso per garantire che il liquido venga assorbito prontamente, riducendo al minimo le possibilità di contatto accidentale tra i punti del campione.
   4. Incubare le piastre O/N, facendo attenzione a non far crescere eccessivamente le piastre in modo che le colonie rimangano piccole e discrete.
      nota: A seconda del mezzo di crescita batterica e della temperatura di incubazione utilizzata, le colonie derivate dal microbiota intestinale endogeno della mosca possono eventualmente apparire sulla piastra. Tuttavia, la maggior parte dei batteri utilizzati per l'infezione patogena cresce molto più velocemente del microbiota intestinale su agar LB a 37 °C.
   5. Rimuovere le piastre dall'incubatrice quando i batteri sperimentali hanno sviluppato colonie visibili (in genere 8-12 ore), ma prima che compaiano le colonie di microbiota intestinale di Drosophila (circa 36 ore). Per i batteri sperimentali a crescita lenta, utilizzare un antibiotico selettivo nell'agar LB per rimuovere eventuali colonie dal microbiota intestinale.
   6. Conta il numero di colonie per ogni omogeneizzato.
      1. Per le piastre a spirale, contare le colonie che crescono utilizzando un contatore di colonie automatizzato in grado di stimare la carica batterica per ml di omogenato in base al numero e alla posizione delle colonie sulla piastra.
         NOTA: I conteggi a spirale sono più accurati quando la concentrazione batterica è compresa tra 5 x 10² e 5 x 10⁴ batteri per ml.
      2. Per le piastre spot, contare manualmente le colonie per ogni mosca da qualsiasi diluizione contenga 30 - 300 colonie e calcolare il numero di batteri per ml di omogeneizzato originale.
2. Analizza i dati.
   1. Se la carica batterica non è normale, trasformare i dati per approssimare meglio una distribuzione normale o analizzare i dati utilizzando l'analisi statistica non parametrica (ad esempio, il test U di Mann-Whitney). Utilizzare un'analisi Box-Cox per trovare la trasformazione ottimale; Le trasformazioni logaritmiche naturali o in base -10 sono spesso efficaci.
   2. Se i dati sono distribuiti in modo sufficientemente normale e ci sono solo due trattamenti da contrastare, eseguire un test t per determinare se i due trattamenti determinano cariche batteriche medie diverse. Se sono presenti più variabili sperimentali o altri fattori potenzialmente predittivi, utilizzare l'analisi della varianza (ANOVA) per determinare quali fattori sono predittori significativi della carica batterica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre di Petri con coperchi trasparenti, cresta rialzata; 100 x 15 mm;	VWR internazionale	Codice 25384-302
LB Agar, Miller	Difco	Codice 244520
Anello di inoculazione	VWR internazionale	Codice 80094-488
Provette per microcentrifuga da 1,5mL; Rito del Sigillo	Stati Uniti Scientific Inc.	1615-5500
Pestello motorizzato; Agitatore da laboratorio Talboys	Troemner	103
Talboys Omogeneizzatore ad alta produttività	Diagnostica OPS	930145
5/32'' Sfere di macinazione	Diagnostica OPS	GBSS 156-5000-01
Genio del Vortice	Industrie scientifiche inc.	G560
Pipettatore multicanale (10uL-300uL)	Sartorius	Codice 730360
WASP2 Whitley Piatto a spirale automatizzato	Microbiologia Internazionale
Contatore automatico di colonie / contapiatti / lettore di piastre ProtoCOL	Microbiologia Internazionale
incubatrice	Poteri scientifici, Inc	DROS52SD