Test per determinare la dose infettiva virale del virus Drosophila C in cellule di insetto in coltura

Abstract

Fonte: Yang, S. et al., Stabilimento dell'infezione virale e analisi dell'interazione ospite-virus in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, dimostriamo il test dell'effetto citopatico per determinare la dose virale infettiva in coltura tissutale del virus Drosophila C sulle cellule Drosophila S2*. Una serie di concentrazioni virali viene utilizzata per infettare le cellule in coltura. Viene determinata la percentuale di cellule che presentano cambiamenti strutturali e questi dati vengono utilizzati per calcolare la dose infettiva della coltura tissutale.

Protocollo

1. Misurazione del carico virale di Drosophila C mediante test CPE

1. Scegliere 5 provette contenenti virus casuali per determinare la dose infettiva media di coltura tissutale virale (TCID₅₀) mediante un test di effetto citopatico (CPE) (1 unità di TCID₅₀= 0,7 unità formanti placche [PFU]).
   nota: La CPE si riferisce ai cambiamenti strutturali nelle cellule ospiti causati dall'invasione virale. Il virus infettante provoca la lisi della cellula ospite o quando la cellula muore senza lisi a causa dell'incapacità di riprodursi.
2. Il giorno 1, raccogliere le cellule S2* preparate mediante pipettaggio. Conta il numero di cella. Centrifugare le celle per 300 x g per 4 minuti e scartare il surnatante. Diluire le cellule alla densità di 1 x 10⁶ cellule/mL con un terreno completo per cellule S2*.
3. Seminare 1 x 10⁵ celle S2* (100 μL) per pozzetto nella piastra a fondo piatto da 96 pozzetti (~30% di confluenza).
4. Eseguire diluizioni seriali di 10 volte del DCV con terreno completo per celle S2*. Aggiungere 50 μl di diluizioni nel pozzetto. Aggiungere 50 μL di terreno di coltura senza virus al pozzetto classificato come pozzetto di controllo negativo.
   nota: Per ogni tasso di diluizione sono stati utilizzati 8 pozzetti. Poiché la resa tipica di DCV è di circa 10 8-10⁹ PFU/mL, la diluizione dovrebbe coprire almeno ~10^−5-10−10.
5. Il giorno 4, osservare il CPE con un microscopio a campo chiaro con un obiettivo 20X o 40X. Classificare un pozzetto in cui le cellule appaiono sfocate e il terreno è pieno di frammenti come un "pozzetto positivo" e un pozzetto in cui la morfologia cellulare è normale come un "pozzetto negativo".
6. Contrassegnare i pozzetti CPE positivi o negativi rispettivamente con + o –. Calcola il virus TCID₅₀ con il metodo di Reed e Muench.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml	marchio	Codice 352070
Piatto per coltura cellulare da 10 cm	sigma	CLS430167	Coltura cellulare
incubatore cellulare	Sanyo	MIR-553
centrifuga	Eppendorf	5810R
centrifuga	Eppendorf	5424R
Incubatrice di Drosophila	Percival	I-41NL	Allevare la Drosophila
FBS	Invitrogen	Codice 12657-029	Coltura cellulare
Insetto di Schneider Medium	sigma	S9895	Coltura cellulare
Software statistici	GraphPad Prisma 7
Piastra a fondo piatto a 96 pozzetti	sigma	CLS3922	Coltura cellulare
incubatore cellulare	Sanyo	MIR-553
microscopio	Olimpo	CKX41