Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Raccolta del midollo osseo
- Rimuovere asetticamente il femore e la tibia da un topo e pulire le ossa utilizzando strumenti sterili. Mettere le ossa pulite in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 5 mM di acido N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-etansolfonico (HEPES) + 0,2 mg/mL di L-glutammina + 0,05 mM di 2-mercaptoetanolo + 50 mg/mL di gentamicina solfato + 10.000 U/mL di penicillina/streptomicina + 10% di siero fetale bovino (FBS, DMEM-10 completo) e incubare la provetta su ghiaccio per 15 minuti.
- Rimuovere le articolazioni sferiche prossimali e distali utilizzando le forbici. Inserire un ago da 25 G collegato a una siringa da 10 ml riempita di terreno nella cavità delle ossa. Sciacquare il midollo osseo utilizzando DMEM-10 complete. Risospendere eventuali grumi pipettando delicatamente il terreno su e giù.
- Centrifugare le cellule per 10 minuti a 300 x g e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. A questo punto, congelare le cellule utilizzando FBS al 90% + dimetilsolfossido (DMSO) al 10% o placcare le cellule in una piastra di Petri da 15 cm per differenziare i macrofagi utilizzando un terreno condizionato L929 (passaggio 2.1).
2. Differenziazione dei macrofagi derivati dal midollo osseo
- Utilizzando un terreno di differenziazione preriscaldato (21 mL di DMEM-10 completo e 9 mL di terreno condizionato con cellule L929 come descritto da Swanson et al.), mettere le cellule del midollo osseo in una piastra di Petri non trattata con coltura tissutale di 15 cm (1,2-1,5 x 107 cellule). Incubare la piastra a 37 °C e al 5% di anidride carbonica, o CO2 per 7 giorni. Aggiungere altri 30 mL di terreno di differenziazione alla piastra il giorno 3 o 4.
nota: È importante non utilizzare piastre trattate con coltura di tessuti, poiché i macrofagi saranno difficili da staccare e raccogliere.
- Per raccogliere i macrofagi, lavare la piastra con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e aggiungere 20 mL di PBS freddo + 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Incubare la piastra a 4 °C per 10 minuti. Raccogliere le cellule pipettando il PBS + EDTA sulle cellule e lavando la piastra con 10 mL di PBS. Combinare entrambi i lavaggi in due provette coniche da 15 mL.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 minuti e risospendere le cellule in 10 mL di DMEM libero da rosso fenolo + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL di L-glutammina + 0,05 mM di 2-mercaptoetanolo + 5% FBS (DMEM-5) e contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di Coulter. Mantenere le cellule in ghiaccio durante il conteggio.
- Seminare i macrofagi in piastre rivestite di coltura tissutale a 2 x 105 cellule/mL. Per gli esperimenti di microscopia, seminare 1 mL di cellule su vetrini coprioggetti in piastre a 24 pozzetti. Per i saggi di rilascio della lattato deidrogenasi (LDH), seminare 100 μL di cellule in una piastra a 96 pozzetti. Per il test LDH, seminare 9 pozzetti (3 pozzetti non trattati, 3 pozzetti con controlli di lisi al 100% e 3 pozzetti per lo stimolo sperimentale).
- Centrifugare la piastra a 96 pozzetti per 5 minuti a 300 x g per assicurarsi che le celle siano distribuite uniformemente nel pozzetto.
- Incubare la piastra per una notte a 37 °C + 5% CO2 prima di iniziare il processo di primering.
3. Adescamento
- Sostituire il terreno con un terreno fresco (DMEM-5) contenente 100 ng/mL di lipopolisaccaride o LPS (500 μL per la piastra a 24 pozzetti o 50 μL per la piastra a 96 pozzetti).
nota: Ci sono una varietà di variazioni strutturali nell'LPS, che influenzano la capacità di stimolare il priming mediato da TLR4. LPS da Salmonella minnesota R595 (Re) è disponibile da più fornitori ed è consigliato.
- Incubare la piastra per 3 ore a 37 °C e 5% di CO2.
4. Attivazione dell'inflammasoma NLRP3 con nigericina e marcatura con FAM-YVAD-FMK
- Rimuovere il terreno e sostituirlo con 290 μL di DMEM-5 contenente 5 μM di nigericina e 5 mM di glicina. La glicina viene aggiunta per ridurre la quantità di lisi cellulare che si verifica durante l'attivazione della caspasi-1. Incubare per 60 minuti a 37 °C e 5% CO2. Utilizzare sia macrofagi selvatici che carenti di caspasi-1 per garantire che l'etichettatura osservata sia specifica per la caspasi-1.
- Durante gli ultimi 45 minuti, aggiungere 10 μL di 30x FAM-YVAD-FMK, preparato secondo le istruzioni del produttore.
- Dopo 60 minuti, rimuovere il terreno e lavare le cellule tre volte per 5 minuti ciascuna con 1 ml di PBS freddo.
- Aggiungere 250 μL di paraformaldeide al 2% in ogni pozzetto e incubare su ghiaccio coperto con un foglio di alluminio per 30 minuti.
- Durante gli ultimi 5 minuti, aggiungere 4 μL di colorante di acido nucleico fluorescente rosso lontano 0,2 mM per marcare i nuclei. Il 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) o altri coloranti possono essere utilizzati anche per marcare il DNA.
- Lavare le cellule tre volte con 1 mL di PBS freddo e montare i vetrini coprioggetti sui vetrini del microscopio utilizzando un terreno di montaggio anti-sbiadimento da 7 μL. Lasciare indurire il mezzo di montaggio per una notte prima di sigillare il vetrino coprioggetti sul vetrino del microscopio utilizzando lo smalto per unghie.
- Imaging dei macrofagi mediante microscopia confocale. Ex/Em per FAM-YVAD-FMK è 492/520 nm e 642/661 per la colorazione con acido nucleico fluorescente rosso lontano. Assicurarsi di impostare il microscopio in modo tale che le cellule non trattate non mostrino alcuna colorazione di fondo nel canale 488. In caso contrario, verrà rilevata la colorazione di fondo FAM-YVAD-FMK e non la caspasi-1 attiva effettiva.
5. Imaging di macrofagi marcati mediante microscopia confocale
NOTA: Le cellule colorate possono essere visualizzate dopo che i vetrini coprioggetti sono stati lasciati indurire durante la notte e sono stati sigillati al vetrino del microscopio con smalto per unghie. Qui viene descritto l'imaging con un microscopio confocale. Le cellule possono anche essere visualizzate con la microscopia a fluorescenza standard.
- Posizionare il vetrino con le cellule di controllo non trattate sul tavolino del microscopio e focalizzare il microscopio sulle cellule.
- Utilizzando le impostazioni della Look Up Table (LUT) del microscopio, regolare l'offset in modo che non vi sia alcuna colorazione FAM-YVAD-FMK positiva nelle cellule non trattate. Questo processo può essere eseguito anche utilizzando macrofagi carenti di caspasi-1.
nota: L'offset deve essere regolato per ogni canale utilizzato nell'esperimento, ma l'impostazione dell'offset corretto è più critica per il canale FAM-YVAD-FMK e i canali degli anticorpi fluorescenti. L'offset per il canale del DNA è meno critico. Una volta impostato l'offset, non regolare questa impostazione per il resto dell'esperimento.
- Passare il vetrino al campione trattato con nigericina. Trovare un campo che contenga sia le cellule positive che quelle negative per la colorazione FAM-YVAD-FMK. Regolare il piano di imaging del canale FAM-YVAD-FMK sul piano che ha la massima intensità di colorazione positiva. Questo sarà normalmente il piano in cui viene ripreso il centro del fuoco dell'inflammasoma.
- Regola il guadagno in modo tale che i focolai siano visibili nelle cellule che hanno nuclei condensati. Dopo aver impostato sia il guadagno che l'offset, lasciare queste impostazioni per il resto della sessione di imaging.
nota: Un modo semplice per determinare se una cellula è piroptotica è osservare la morfologia nucleare. Le cellule con caspasi-1 attiva hanno nuclei arrotondati e condensati, mentre i nucleoli sono visibili nelle cellule senza attivazione della caspasi-1 e la morfologia nucleare è simile a quella delle cellule non trattate.
- Raccogli le immagini di 5 campi selezionati casualmente con un ingrandimento totale di 100X. Questo normalmente si traduce in circa 40 celle per immagine. Ripetere questo processo per ogni campione.
- Conta il numero di celle in ogni immagine utilizzando il software di analisi delle immagini. Quindi contare il numero di cellule che hanno una colorazione FAM-YVAD-FMK positiva. Rappresenta il livello di attivazione della caspasi-1 come la percentuale di cellule FAM-YVAD-FMK positive.
