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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Differenziazione dei macrofagi derivati dal midollo osseo
- Utilizzando un terreno di differenziazione preriscaldato (21 mL di DMEM-10 completo e 9 mL di terreno condizionato con cellule L929 come descritto da Swanson et al.), mettere le cellule del midollo osseo in una piastra di Petri non trattata con coltura tissutale di 15 cm (1,2-1,5 x 107 cellule). Incubare la piastra a 37 °C e 5% di CO2 per 7 giorni. Aggiungere altri 30 mL di terreno di differenziazione alla piastra il giorno 3 o 4,
nota: È importante non utilizzare piastre trattate con coltura di tessuti, poiché i macrofagi saranno difficili da staccare e raccogliere.
- Per raccogliere i macrofagi, lavare la piastra con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e aggiungere 20 mL di PBS freddo + 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Incubare la piastra a 4 °C per 10 minuti. Raccogliere le cellule pipettando il PBS + EDTA sulle cellule e lavando la piastra con 10 mL di PBS. Combinare entrambi i lavaggi in due provette coniche da 15 mL.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 minuti e risospendere le cellule in 10 mL di DMEM libero da rosso fenolo + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL di L-glutammina + 0,05 mM di 2-mercaptoetanolo + 5% FBS (DMEM-5) e contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di Coulter. Mantenere le cellule in ghiaccio durante il conteggio.
- Seminare i macrofagi in piastre rivestite di coltura tissutale a 2 x 105 cellule/mL. Per gli esperimenti di microscopia, seminare 1 mL di cellule su vetrini coprioggetti in piastre a 24 pozzetti. Per i saggi di rilascio di LDH, seminare 100 μL di cellule in una piastra a 96 pozzetti. Per il test LDH, seminare 9 pozzetti (3 pozzetti non trattati, 3 pozzetti con controlli di lisi al 100% e 3 pozzetti per lo stimolo sperimentale).
- Centrifugare la piastra a 96 pozzetti per 5 minuti a 300 x g per assicurarsi che le celle siano distribuite uniformemente nel pozzetto.
- Incubare la piastra per una notte a 37 °C + 5% CO2 prima di iniziare il processo di primering.
2. Adescamento
- Sostituire il terreno con un terreno nuovo (DMEM-5) contenente 100 ng/mL di LPS (500 μL per la piastra a 24 pozzetti o 50 μL per la piastra a 96 pozzetti).
nota: Ci sono una varietà di variazioni strutturali nell'LPS, che influenzano la capacità di stimolare il priming mediato da TLR4. LPS da Salmonella minnesota R595 (Re) è disponibile da più fornitori ed è consigliato.
- Incubare la piastra per 3 ore a 37 °C e 5% di CO2.
3. Attivazione dell'inflammasoma NLRP3 con nigericina
- Rimuovere il terreno e sostituirlo con 290 μL di DMEM-5 contenente 5 μM di nigericina e 5 mM di glicina. La glicina viene aggiunta per ridurre la quantità di lisi cellulare che si verifica durante l'attivazione della caspasi-1. Incubare per 60 minuti a 37 °C e 5% CO2. Utilizzare sia macrofagi selvatici che carenti di caspasi-1 per garantire che l'etichettatura osservata sia specifica per la caspasi-1.
- Dopo 60 minuti, rimuovere il terreno e lavare le cellule tre volte per 5 minuti ciascuna con 1 ml di PBS freddo.
4. Colorazione degli anticorpi
NOTA: Per etichettare le cellule con anticorpi per rilevare ASC, seminare, adescare ed esporre le cellule alla nigericina è identico alla sezione precedente. La lavorazione successiva è la seguente:
- Lavare le cellule tre volte per 5 minuti ciascuna con 1 ml di PBS freddo. Aggiungere 250 μl di soluzione di fissazione e permeabilizzazione. Incubare le cellule sul ghiaccio e coprire per 30 minuti.
- Lavare i macrofagi tre volte per 5 minuti ciascuno con 1 mL di tampone di lavaggio.
- Aggiungere 250 μl di anticorpo primario contro l'ASC diluito 1:500 in tampone di lavaggio e incubare per 1 ora su ghiaccio. Includi un vetrino coprioggetti che non riceve alcun anticorpo primario, ma riceverà solo il secondario. Questo vetrino coprioggetti verrà utilizzato durante la configurazione del microscopio per impostare l'offset corretto.
- Lavare le cellule tre volte per 5 minuti ciascuna con 1 mL di tampone di lavaggio.
- Aggiungere 250 μl di anticorpo secondario (colorante fluorescente coniugato capra-anti-topo) diluito 1:500 in tampone di lavaggio e incubare per 1 ora su ghiaccio. Aggiungere 4 μL di colorante di acido nucleico fluorescente rosso lontano 0,2 mM per gli ultimi 5 minuti di questa incubazione per marcare i nuclei.
- Lavare le cellule 3 volte con 1 mL di tampone di lavaggio a freddo e montare i vetrini coprioggetti sui vetrini del microscopio utilizzando un terreno di montaggio anti-sbiadimento da 7 μL. Lasciare indurire il mezzo di montaggio per una notte prima di sigillare il vetrino coprioggetti sul vetrino del microscopio utilizzando uno smalto trasparente.
- Immagine dei macrofagi mediante microscopia confocale. Ex/Em per l'anticorpo secondario è 555/580 nm e 642/661 per la colorazione dell'acido nucleico fluorescente rosso lontano.