Un test di rilascio di lattato deidrogenasi per rilevare la morte dei macrofagi a seguito di esposizione alla nigericina

Abstract

Fonte: den Hartigh, A.B. et al., Rilevamento dell'attivazione dell'inflammasoma e della morte delle cellule piroptotiche nei macrofagi derivati dal midollo osseo murino. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra il test della lattato deidrogenasi per rilevare la morte dei macrofagi mediata dall'inflammasoma. I macrofagi sono esposti al lipopolisaccaride per il priming, seguito dall'esposizione alla nigericina per causare la morte cellulare indotta dall'inflammasoma, che è determinata dal saggio della lattato deidrogenasi.

Protocollo

1. Saggio di rilascio LDH

NOTA: Per il test di rilascio LDH, seminare le cellule in una piastra da 96 pozzetti. Non rimuovere il fluido dopo l'adescamento.

1. Sostituire il terreno con un terreno fresco (DMEM-5: 10 mL di DMEM privo di rosso fenolo + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL di L-glutammina + 0,05 mM di 2-mercaptoetanolo + 5% FBS) contenente 100 ng/mL di LPS in pozzetti contenenti cellule macrofagiche aderenti (500 μL per le piastre a 24 pozzetti o 50 μL per le piastre a 96 pozzetti).
   nota: Ci sono una varietà di variazioni strutturali nell'LPS, che influenzano la capacità di stimolare il priming mediato da TLR4. Si consiglia LPS da Salmonella minnesota R595 (Re).
2. Incubare la piastra per 3 ore a 37 °C e 5% di CO₂.
3. Aggiungere 50 μL di DMEM-5 contenente 10 μM di nigericina ai pozzetti sperimentali e 50 μL di DMEM-5 ai pozzetti di controllo spontaneo e al 100% della lisi. Incubare per 60 minuti a 37 °C e 5% CO₂.
4. Dopo 30 minuti, aggiungere 10 μL di tampone di lisi 10x ai pozzetti di controllo della lisi al 100% e aggiungere 10 μL di DMEM-5 agli altri pozzetti. Durante questa incubazione, rimuovere 1 fiala di miscela di substrato (1,5 mL di substrato liofilizzato) e 1 aliquota di tampone per saggi (~12 mL) dal congelatore e lasciarli scongelare al riparo dalla luce a temperatura ambiente.
   nota: La miscela di substrato contiene un sale di tetrazolio (iodonitrotetrazolio violetto), che viene convertito in un prodotto di formazan rosso.
5. Dopo 60 minuti di incubazione totale, centrifugare la piastra per 5 minuti a 500 x g a 10 °C. Trasferire 50 μl di surnatante in una piastra trasparente a fondo piatto. Durante questo periodo, aggiungere 12 mL di tampone di saggio alla fiala della miscela di substrato e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti prima dell'uso.
6. Aggiungere 50 μL di substrato a ciascun pozzetto e incubare per 30 minuti al buio. Includi solo spazi medi per i valori vuoti. Controllare la targa dopo 15 minuti per assicurarsi che il segnale non superi il limite di rilevamento del lettore di piastre.
7. Dopo 30 minuti, aggiungere 50 μL di soluzione di arresto (acido acetico 1 M) e misurare OD₄₉₀ utilizzando un lettore di piastre.
8. Calcolare la percentuale di lisi cellulare utilizzando la seguente formula:
   % Citotossicità = ((Sperimentale - Spontanea)/(Massimo - Spontanea))×100
   Sperimentale: cellule trattate con nigericina; spontanee: cellule non trattate; Massimo: cellule esposte al tampone di lisi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cytotox96 Saggio di citotossicità non radioattiva	Fisher Scientifico	PR-G1780	Include la miscela di substrato e il tampone di analisi; Formulazioni proprietarie. La soluzione di arresto è 1 M di acido acetico
DMEM, glicemia alta, senza glutammina, senza rosso fenolo	Invitrogen	31053028
PBS di Dulbecco, niente calcio, niente magnesio	Invitrogen	14190144
Siero fetale bovino, qualificato, origine statunitense	Invitrogen	26140079	Inattivato a caldo a 55°C per 50 min
Gentamicina	Invitrogen	15750060
LPS ultrapuro da Salmonella minnesota R595 (Re)	Elenco Biologici	434
Lettore di piastre Spectramax M3	Dispositivi molecolari	5000414
L-Glutammina	Invitrogen	21051024