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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Isolamento di neutrofili sani
- Ottenere 20 mL di sangue periferico da un donatore sano in due provette da 10 mL rivestite di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
- Mettere 10 mL di sangue in una provetta sterile da 50 mL e aggiungere soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) fino a 32,5 mL.
- Aggiungere il gradiente di densità (ad esempio, Ficoll-amidotrizoaat) sotto le cellule.
- Prelevare 14 mL di gradiente di densità con una pipetta da 10 mL e un controller per pipette.
- Posizionare la pipetta sul fondo della provetta da 50 ml.
- Estrarre il controller della pipetta dalla pipetta, lasciando che il gradiente di densità fuoriesca dalla pipetta per gravità fino a raggiungere il massimo per effetto capillare (rimarranno 1-2 mL), senza utilizzare il motore.
- Rimuovere la pipetta posizionando un pollice sulla parte superiore della pipetta, evitando così che il gradiente di densità fuoriesca durante la rimozione della pipetta.
- Far girare i tubi per 20 minuti a 912 x g e temperatura ambiente (RT) senza accelerazione o freno.
NOTA: I globuli rossi (RBC) e i neutrofili hanno un'alta densità e si trovano sul fondo della provetta da 50 mL. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono separate e sopra il gradiente di densità come un anello bianco. Il plasma diluito con PBS sarà al di sopra delle PBMC. Se necessario, le PBMC possono essere isolate trasferendo l'anello bianco in una nuova provetta da 50 mL con ulteriori fasi di lavaggio con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Rimuovere con cautela prima l'anello bianco contenente le PBMC, quindi la rimozione del plasma diluito con PBS e infine lo strato di gradiente di densità il più possibile.
- Per isolare i neutrofili dalla miscela neutrofilo/eritrociti, lisare gli eritrociti con acqua distillata fredda e sterile.
- Prendi dal frigorifero una bottiglia di acqua distillata sterile fredda e una fiaschetta di PBS concentrata 10x.
- Lavora rapidamente per questo passaggio. Aggiungere 36 ml di acqua distillata sterile fredda direttamente sopra il pellet e mescolare una volta con cura. Aggiungere 4 mL di PBS 10x dopo 20 s per ottenere una soluzione isotonica. Mescolare una volta con cura.
- Centrifugare la provetta per 5 minuti a 739 x g e 4 °C (per la rimozione dei globuli rossi). I neutrofili saranno nel pallino bianco.
- Eliminare con cautela il surnatante. Eseguire nuovamente il passaggio 1.6.2 e assicurarsi che il pellet sia sospeso correttamente.
- Centrifugare il tubo per 5 minuti a 328 x g e 4 °C.
- Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di PBS. Conta i neutrofili e tienili sul ghiaccio.
NOTA: La resa attesa da 1 provetta di sangue (10 mL) è di circa 15-75 milioni di neutrofili.
2. Marcatura cellulare fluorescente rossa dei neutrofili
- Preparare una sospensione di neutrofili di 10-20 milioni di neutrofili in 2 mL di PBS in una provetta da 15 mL.
- Preparare una soluzione di 2 mL di PBS con 4 μL di linker di cellule fluorescenti rosse da 2 μM (vedere la Tabella dei materiali) in una provetta diversa da 15 mL. Aggiungerlo delicatamente alla sospensione di neutrofili e mescolare accuratamente.
- Incubare al buio per esattamente 25 minuti a 37 °C per marcare i neutrofili con il linker cellulare fluorescente rosso.
- Inattivare l'etichettatura aggiungendo il terreno 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) inattivato termicamente a RT fino a 15 ml e mescolare una volta con cura. Assicurarsi che il pellet sia risospeso con cura se si è formato un pellet.
- Centrifuga il tubo per 5 minuti a 328 x g e RT.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di terreno RPMI 1640 privo di rosso fenolo contenente il 2% di FBS e il 10% di penicillina/streptomicina (P/S) a RT. Contare i neutrofili.
nota: Una perdita cellulare del 50% può verificarsi dopo la marcatura delle cellule fluorescenti rosse.
3. Induzione della formazione di trappole extracellulari per neutrofili
- Preparare una sospensione cellulare di 0,42 x 106 cellule/mL in terreno RPMI 1640 privo di rosso fenolo contenente il 2% di FBS e il 10% di P/S.
- Aggiungere 37.500 neutrofili in 90 μL per pozzetto in una piastra nera a fondo piatto a 96 pozzetti.
- Aggiungere 10 μl dello stimolo scelto (ad esempio, sieri di un paziente) in triplicato per raggiungere una concentrazione del 10% nel pozzetto. Includere sempre un controllo negativo (medio) in triplicato.
- Incubare al buio a 37 °C per il tempo desiderato, compreso tra 30 minuti e 2, 4 o 6 ore. Si consiglia di incubare per 4 ore.
- Calcolare il volume necessario per aggiungere 25 μL di colorante DNA impermeabile da 5 μM (vedere la Tabella dei materiali), per raggiungere una concentrazione finale di 1 μM nel pozzetto. Effettuare una prediluizione, se necessario, in terreno RPMI 1640 contenente il 2% di FBS e il 10% di P/S per ottenere una concentrazione di 5 μM.
- Aggiungere 25 μl di colorante DNA impermeabile da 5 μM 15 minuti prima della fine del tempo di incubazione. Continuare l'incubazione per altri 15 minuti a 37 °C al buio.
- Rimuovere il surnatante (~125 μL) con molta attenzione e conservarlo se necessario. Aggiungere 100 μl di paraformaldeide (PFA) al 4%. Tieniti all'oscuro e continua immediatamente con il passaggio 4.
4. Trappole extracellulari per neutrofili (NET) Visualizzazione con microscopia confocale 3D ad alto contenuto e ad alta risoluzione in immunofluorescenza
- Configurare le impostazioni sul microscopio confocale a immunofluorescenza facendo clic su Configurazione acquisizione.
- Fare clic sulla scheda Configura.
- Seleziona l'obiettivo e la fotocamera. Scegli l'obiettivo 10X Apo Lambda con modalità di acquisizione di un foro stenopeico confocale da 60 μm.
- Fare clic su Piastra e scegliere la piastra di plastica a 96 pozzetti. Seleziona i siti da visitare e scegli un numero fisso di siti. Riempi 3 colonne e 3 righe senza sovrapposizioni (0 μm), che coprono un totale del 45% del pozzetto.
- Fare clic su Acquisizione. Selezionare Abilita messa a fuoco laser. Se necessario, selezionare Acquisisci serie Z/serie temporale.
- Fare clic su Messa a fuoco automatica del sito.
- Fare clic su Messa a fuoco sul fondo della piastra | Offset per spessore del fondo. Affinché il pozzetto iniziale trovi il campione, scegliere il primo pozzo acquisito. Per la messa a fuoco automatica del sito, scegliere tutti i siti.
- Fare clic su Lunghezze d'onda.
- Per il numero di lunghezze d'onda, scegliere 2. Per il livello di perfezionamento della correzione dell'ombreggiatura TL, scegliere 2.
- Per Lunghezza d'onda 1, selezionare Texas Red.
- Per le opzioni di messa a fuoco automatica, selezionare laser con offset Z, offset post laser 1,1 μm. Utilizzare Z-stack con un intervallo personalizzato di 200-10.
- Per Lunghezza d'onda 2, selezionare isotiocianato di fluoresceina (FITC).
- Per le opzioni di messa a fuoco automatica, selezionare il laser con offset Z da w1 0 μm. Utilizzare Z-stack con un intervallo personalizzato di 200-10.
- Per le opzioni di acquisizione, selezionare Serie Z e Massimo immagine di proiezione 2D. Per le opzioni di acquisizione, selezionare Correzione ombreggiatura | Spento.
- Seleziona Serie Z. Seleziona il numero di passi: 10. Selezionare la dimensione del passo: 3 μm (l'intervallo totale sarà di 27 μm).
- Mettere la piastra nella microscopia confocale a immunofluorescenza.
- Fare clic sulla scheda Esegui.
- Compila il nome e la descrizione della targa e scegli il luogo di stoccaggio.
- Seleziona i pozzetti che devono essere acquisiti.
- Scegli il tempo di esposizione per Texas Red e FITC.
- Fare clic su Acquisisci piastra per avviare l'acquisizione, che richiederà circa 1 ora per piastra.
5. Analisi della formazione NET
- Utilizzare un programma di elaborazione delle immagini progettato per l'analisi di immagini scientifiche multidimensionali (vedi Tabella dei materiali) per analizzare la formazione di NET.
- Trasferire i dati dell'immagine acquisita su un disco rigido separato.
- Seleziona lo strumento per l'aggiunta del colore.
- Seleziona w1 e scegli la cartella nel disco rigido in cui sono memorizzati i dati.
- Seleziona w2 e scegli la cartella nel disco rigido in cui sono memorizzati i dati.
nota: Utilizzare una macro standard che utilizza w1 nel nome del file per aggiungere il colore rosso alle immagini Texas Red e utilizza w2 per aggiungere il colore verde alle immagini FITC.
- Selezionare Macro di analisi.
- Selezionare w1 e scegliere il valore di soglia (soglia di intensità), che di solito è 10. Selezionare il valore del pixel desiderato (soglia di dimensione, ad es. 100).
- Selezionare w2 e scegliere il valore di soglia (soglia di intensità), che di solito è 10. Selezionare il valore del pixel desiderato (soglia di dimensione, ad es. 500).
- Scegli la destinazione per il file del foglio di calcolo, esegui l'analisi e salva i file di registro in seguito.
- Analizza i dati in un foglio di calcolo.