Isolamento di lipidi da neutrofili derivati dal sangue umano mediante separazione bifasica

Abstract

Fonte: Brogden, G., et al. Metodi per studiare le alterazioni lipidiche nei neutrofili e la successiva formazione di trappole extracellulari per neutrofili. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video dimostra l'isolamento dei lipidi dai neutrofili umani mediante un sistema di solventi bifasici che utilizza metanolo e cloroformio.

Protocollo

1. Isolamento dei lipidi e analisi dei neutrofili derivati dal sangue umano

1. Prendi i neutrofili e mettili sul ghiaccio.
2. Sul ghiaccio, pipettare i neutrofili (presenti nella soluzione di metanolo e cloroformio) in una provetta di vetro da 15 ml con tappo a vite e sigillare in politetrafluoroetilene (PTFE) e omogeneizzarli agitando per 1 minuto. Utilizzare provette di vetro per evitare che i lipidi si leghino alle superfici di plastica. Utilizzare cappucci in PTFE per evitare la contaminazione da gomma/plastica.
3. Aggiungere 2 mL di metanolo seguiti 1 minuto dopo da 1 mL di cloroformio. Agitare di nuovo per 1 minuto.
4. Ruotare i tubi di vetro a RT e 50 giri/min per 30 minuti.
5. Pellettare la frazione proteica centrifugando la soluzione a 7 °C e 1,952 x g per 10 min.
6. Decantare con cura il surnatante in una nuova provetta di vetro da 15 ml con tappo a vite, lasciando il pellet contenente proteine. Conservare il pellet a -20 °C per una futura quantificazione.
7. Aggiungere 1 mL di cloroformio, attendere 1 minuto, aggiungere 1 mL di acqua a doppia distillazione e capovolgere la provetta di vetro con tappo a vite con il campione per 30 s.
8. Centrifugare a 7 °C e 1,952 x g per 10 minuti e scartare la fase superiore, fino allo strato torbido escluso.
9. Se necessario, eseguire un'ulteriore fase di purificazione opzionale ripetendo il passaggio 1.1.8.
10. Essiccare i campioni in un concentratore sottovuoto a 60 °C e conservarli a -20 °C fino al momento del bisogno.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa da 10 μl	Hamilton	701 NR 10 μl
Cannula 26G	Braun	4657683
cloroformio	Carl Roth	Codice: 7331.1
metanolo	Carl Roth	Codice: 7342.1
Acqua	Carl Roth	3255.1	Senza endotossine