Un test di rilascio di lattato deidrogenasi per rilevare l'infezione da Cryptococcus neoformans nei macrofagi

Abstract

Fonte: Ball, B., et al. Flusso di lavoro di proteomica quantitativa senza etichetta per interazioni ospite-patogeno guidate dalla scoperta. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, dimostriamo un test di citotossicità per valutare l'infezione da Cryptococcus neoformans, un fungo patogeno, nei macrofagi. La citotossicità è determinata dal rilascio dell'enzima lattato deidrogenasi citoplasmatico dovuto alla lisi dei macrofagi causata dall'infezione da Cryptococcus neoformans.

Protocollo

1. Verifica dell'infezione

NOTA: Utilizzando un test di citotossicità, è possibile misurare la competenza nell'infezione. Il seguente protocollo evidenzierà l'applicazione di un prodotto di citotossicità per misurare il rilascio di LDH (lattato deidrogenasi). Possono essere utilizzati anche altri prodotti per la citotossicità

1. Preparazione dell'infezione da C. neoformans delle cellule macrofagiche
   1. Preparazione delle cellule fungine
      1. Utilizzando un brodo di glicerolo, striare il ceppo di C. neoformans wildtype (H99) su una piastra di agar peptone destrosio (YPD) estratto di lievito per isolare singole colonie.
      2. Incubare per una notte per 16 ore a 37 °C in un'incubatrice statica.
      3. Selezionare una singola colonia di ceppo wildtype di C. neoformans e coltivare in 5 ml di brodo YPD in una provetta da 10 ml con tappo largo. Eseguire in quadruplice copia.
      4. Incubare per una notte per 16 ore a 37 °C in un incubatore vibrante a 200 giri/min.
      5. Il giorno seguente le sottocolture vengono coltivate durante la notte, ciascuna in una diluizione 1:100 in 3 ml di brodo YPD.
      6. Misurare i valori di densità ottica (OD_{600 nm}) della coltura fungina per determinare la fase di log intermedio. A seconda dello spettrofotometro, il ceppo wild-type di C. neoformans raggiunge la fase logaritmica media, comunemente dopo un'incubazione da 6 a 8 ore in YPD con valori generali di OD_600nm compresi tra 1,0 e 1,5.
      7. Una volta che le cellule raggiungono la fase di log intermedio, prelevare un'aliquota di 10 μl di sospensione di cellule fungine in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 mL e diluire 1:100 in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
      8. Raccogliere e centrifugare le celle a 1.500 x g per 10 minuti, lavare delicatamente il pellet con PBS sterile a temperatura ambiente e ripetere l'operazione per un totale di tre lavaggi.
      9. Risospendere le cellule in un terreno di coltura cellulare privo di antibiotici per ottenere una concentrazione di 1,2 x 10⁸ cellule/mL.
   2. Preparazione delle cellule macrofagiche
      1. Visualizzare ogni pozzetto nella piastra a 6 pozzetti per assicurarsi che le celle abbiano raggiunto il 70-80% di confluenza. In alternativa, le cellule possono essere misurate per ottenere circa 1,2 x 10⁶ cellule macrofagiche per pozzetto.
      2. Terreno caldo integrato con antibiotici a 37 °C prima del lavoro di coltura cellulare. Assicurarsi che l'ambiente di lavoro sia sterilizzato prima del lavoro di coltura cellulare. Visualizzate le cellule utilizzando un microscopio ottico per assicurarvi che le cellule siano aderenti e sane.
      3. Rimuovere il terreno di coltura cellulare dalla piastra con una pipetta sierologica o un aspiratore a vuoto.
      4. Aggiungere delicatamente 5-7 mL di PBS sterile a temperatura ambiente (soluzione salina tamponata con fosfato) alla piastra da 60 x 15 mm.
      5. Inclinare delicatamente il piatto per lavare le cellule aderenti.
   3. Co-coltura di C. neoformans e cellule macrofagiche
      1. Aggiungere 1 mL di cellule di C. neoformans risospese a 4 pozzetti contenenti cellule macrofagiche.
         nota: Il numero di piastre necessarie dovrà essere calcolato prima di iniziare l'esperimento. Aggiungere 1 ml di terreno privo di antibiotici ai pozzetti vuoti.
      2. Lasciare incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% per 3 ore.
      3. Rimuovere il terreno di coltura cellulare dalla piastra con una pipetta sierologica o un aspiratore a vuoto.
      4. Aggiungere delicatamente 1 ml di PBS sterile a temperatura ambiente.
      5. Inclinare delicatamente la piastra per lavare le cellule extracellulari di C. neoformans non attaccate o non fagocitate.
      6. Aggiungere 1 mL di terreno privo di antibiotici a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti.
      7. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂.
   4. In punti temporali selezionati (ad esempio, 1, 3, 6, 12 e 24 ore) raccogliere il surnatante per misurare il rilascio di LDH secondo le istruzioni del produttore.
   5. Allo stesso tempo, le cellule macrofagiche non infette saranno lisate a un determinato valore per la massima citotossicità.
   6. Calcolare la citotossicità come segue:
      

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
100 mM Tris-HCl, pH 8,5	Fisher Scientifico	BP152-1	Mantenere a 4°C
Piatto 60 x 15 mm, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientifico	174888
piastra per coltura cellulare a 6 pozzetti	ThermoFisher Scientifico	140675
Provette coniche falcon (15 mL)	Fisher Scientifico	05-539-12
Contacellule automatizzato Countess II	ThermoFisher Scientifico	AMQAX1000	Non indispensabile, l'emocitometro può essere utilizzato in alternativa.
CytoTox 96 Saggio di citotossicità non radioattiva	Promega	G1780
DMEM, glucosio alto, integratore GlutaMAX	ThermoFisher Scientifico	10566016
Siero fetale bovino (FBS)	ThermoFisher Scientifico	12483020	Inattivare il calore incubando a 60°C per 30 minuti. Preparare 50 ml di aliquote e congelare rapidamente. Scongelare prima della preparazione del terreno
Emocitometro	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Preparare 40 mM di HEPES/8 M di urea in soluzione madre, surgelata istantaneamente, conservare a -20°C fino al momento dell'uso. Gettare dopo ogni utilizzo (non congelare-scongelare ripetutamente).
L-glutammina	ThermoFisher Scientifico	25030081	Può essere aliquotato e congelato per la conservazione. Scongelare prima della preparazione del terreno.
Microcentrifuga	Eppendorf	13864457
Penicillina : Streptomicina 10k/10k	VWR	CA12001-692	Può essere aliquotato e congelato per la conservazione. Scongelare prima della preparazione del terreno.
Soluzione salina tamponata con fosfato	VWR	CA12001-676	Acquisto non richiesto. Il PBS può anche essere preparato, ma la filtrazione sterile deve essere eseguita prima dell'uso.
Pipetta, sierologica monouso (10 mL)	Fisher Scientifico	13-678-11E
Pipetta, sierologica monouso (25 mL) Basix	Fisher Scientifico	14955235
Miscela di proteasi tripsina/Lys-C, grado MS	perforare	Codice: A40007	Mantenere a -20 °C.
urea	Sigma Aldrich	U1250-1KG	Preparare 40 mM di HEPES/8 M di urea in soluzione madre, surgelata in flash, conservare a -20 °C fino al momento dell'uso. Gettare dopo ogni utilizzo (non congelare-scongelare ripetutamente).
Brodo di destrosio peptone estratto di lievito	BD Difco	BM20