Un sistema di infezione basato su inserti a membrana permeabile per studiare l'impatto delle tossine batteriche

Abstract

Fonte: Flaherty, R. A., et al. Implementazione di un sistema di infezione basato su inserti di membrana permeabile per studiare gli effetti delle tossine batteriche secrete sulle cellule ospiti dei mammiferi. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video mostra un sistema di infezione basato su inserti a membrana permeabile per valutare l'impatto delle tossine batteriche secrete. Eliminando il contatto diretto tra il patogeno batterico e le cellule ospiti utilizzando una membrana permeabile, questa tecnica consente di studiare l'effetto delle tossine secrete dai batteri patogeni sulle cellule ospiti dei mammiferi.

Protocol

1. Coltura batterica

1. Generare ceppi mutanti isogenici da utilizzare per lo studio dello specifico fattore secreto di interesse.
   nota: I ceppi GAS (Group A Streptococcus) M1T1 5448 utilizzati per questi esperimenti includevano WT (Wild type) GAS', un mutante sagAΔ cat SLS-deficiente (sag = gene associato alla streptolisina S, SLS = streptolisina S) (abbreviato nel testo come ΔsagA) e un ceppo complementato a sagA (abbreviato nel testo come ΔsagA+sagA).
2. Preparare colture liquide notturne di ceppi batterici di interesse. Coltivare i ceppi GAS M1T1 5448 in 10 ml di brodo Todd-Hewitt a 37 °C per 16-20 ore prima di infettare le cellule umane.
3. Centrifugare colture batteriche durante la notte (2.400 rcf per 10 minuti) e risospendere in terreno batterico fresco.
   nota: La risospensione nello stesso volume in cui sono state coltivate le colture notturne (5-10 ml) produce generalmente una densità ottica iniziale desiderabile.
4. Normalizzare le colture batteriche a concentrazioni iniziali uguali diluendo le colture ri-sospese in un terreno batterico aggiuntivo fino a ottenere la stessa densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) per tutti i ceppi da testare (si consiglia OD₆₀₀ di circa 1,0 per comodità).
   nota: In questi studi, sono state utilizzate colture batteriche in fase stazionaria per infettare le cellule ospiti immediatamente dopo la normalizzazione. Tuttavia, poiché alcuni ceppi di batteri escono dalla fase stazionaria in modo non sincrono, potrebbe essere più appropriato iniziare le infezioni dell'ospite con colture in fase logaritmica se si scopre che questo è il caso per i ceppi di interesse.
5. Prima di ulteriori analisi, eseguire un test di conteggio delle colonie per determinare le unità formanti colonie (CFU) per millilitro presenti nelle colture di partenza in modo da poter determinare la molteplicità dell'infezione (MOI) o il rapporto di batteri per cellula ospite.
   1. Preparare diluizioni seriali da 1 ml di colture batteriche che sono state normalizzate alla densità ottica desiderata in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o terreno di crescita batterica appropriato (in questi studi è stato utilizzato il brodo di Todd-Hewitt). Preparare diluizioni che vanno da ^10-1 a ^10-6 per produrre almeno una serie di piastre di agar con colonie numerabili (30-300 colonie). Eseguire tutte le diluizioni in triplice copia.
   2. Trasferire 100 μl di ciascuna diluizione seriale su una piastra di agar contenente il terreno appropriato per la specie batterica da analizzare.
      nota: In questi studi è stato utilizzato l'agar Todd-Hewitt.
   3. Utilizzare uno spandiconcime batterico di vetro o di plastica per distribuire uniformemente l'aliquota da 100 μl su tutta la superficie della piastra di agar e continuare a spargere fino a quando il liquido non è stato assorbito nell'agar. Eseguire sotto fiamma utilizzando una tecnica sterile.
   4. Incubare le piastre di agar a 37 °C per una notte o fino alla comparsa di innumerevoli colonie.
   5. Contare le colonie che crescono su ogni piastra e calcolare i CFU/ml nella coltura originale con la seguente formula: numero di colonie x inverso della diluizione seriale/volume di coltura impiattato in millilitri.
      ad es. (200 colonie x 1/^10-5 diluizione) / 0,1 ml placcato = 2,0 x 10⁸ CFU/ml.

2. Coltura cellulare ospite

1. Ottenere una linea cellulare ospite appropriata per le analisi desiderate.
   nota: Per questi studi sono stati utilizzati cheratinociti epiteliali umani HaCaT, un gentile dono di V. Nizet.
   1. Mantenere le cellule HaCaT in piastre di coltura da 100 mm nel Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco con il 10% di siero fetale bovino (FBS) inattivato termicamente. Incubare a 37 °C con CO₂ al 5%.

3. Infezione della cellula ospite con sistema di inserti a membrana permeabile

1. Piastra le cellule in apposite piastre di coltura tissutale e lasciale crescere fino a raggiungere il 90% di confluenza.
   nota: Le cellule HaCaT utilizzate in questi studi raggiungono tipicamente la confluenza entro 2-3 giorni dalla placcatura.
   1. Per la raccolta del lisato (ad es. analisi di segnalazione e saggi di determinazione dell'adenosina trifosfato (ATP)), piastrate le cellule HaCaT in piastre a 6 pozzetti a una densità di semina di circa 3 x 10⁵ cellule/pozzetto.
   2. Per gli esperimenti di imaging in immunofluorescenza, le cellule vengono piastrate su vetrini di vetro sterili all'interno di piastre a 6 pozzetti con una densità di semina di circa 3 x 10⁵ cellule/pozzetto.
   3. Per i saggi di permeabilizzazione della membrana dell'omodimero di etidio e di rilascio di lattato deidrogenasi (LDH), piastra le cellule HaCaT in piastre da 24 pozzetti a una densità di semina di circa 5 x 10⁴ cellule/pozzetto.
2. Immediatamente prima del trattamento, lavare le celle con 1x PBS sterile.
3. Applicare un terreno di coltura fresco sulle cellule. Per le condizioni qui descritte, applicare 2 ml di terreno per pozzetto per piastre a 6 pozzetti o 0,5 ml di terreno per pozzetto per piastre a 24 pozzetti. Se sono in fase di sperimentazione trattamenti farmacologici, miscelare con terreno fresco e applicare durante questa fase.
   Nota: alcuni saggi possono richiedere terreni alternativi. Ad esempio, poiché il rosso fenolo e le alte concentrazioni sieriche interferiscono con il saggio di rilascio di LDH, per questi esperimenti è stato utilizzato il terreno dell'aquila modificato di Dulbecco privo di fenolo (DMEM) integrato con albumina sierica bovina (BSA) all'1% (p/v), 2 mM di L-glutammina e 1 mM di piruvato di sodio.
4. Dopo l'applicazione del terreno fresco, posizionare con cura un inserto a membrana permeabile sterile da 0,4 μm in ciascun pozzetto. Eseguire questo passaggio in una cappa a flusso laminare e utilizzare una pinza sterile per trasferire l'inserto della membrana permeabile in ciascun pozzetto.
5. Applicare un terreno di coltura cellulare fresco nella camera superiore di ciascun pozzetto secondo le istruzioni del produttore. Per le condizioni qui descritte, applicare 1 ml di terreno per pozzetto per piastre a 6 pozzetti o 0,1 ml di terreno per pozzetto per piastre a 24 pozzetti.
6. Applicare un volume appropriato di colture batteriche normalizzate (vedere paragrafo 1) nella camera superiore del sistema di inserti a membrana permeabile. Utilizzare un mezzo batterico per trattamenti di controllo non infetti. Per i risultati qui descritti, aggiungere 25 μl delle colture normalizzate per camera per piastre a 24 pozzetti e 100 μl delle colture per camera per piastre a 6 pozzetti.
   Nota: In questi studi, il GAS wild-type o mutante è stato applicato alle cellule ospiti con un MOI di 10. Il MOI è stato calcolato sulla base del numero finale di cellule eucariotiche (ad es. 2 x 10⁶ cellule/pozzetto), in modo tale che all'inizio del periodo di infezione siano stati aggiunti 10 volte più batteri per cellula ospite (ad es. 2 x 10⁷ CFU per pozzetto). Il MOI appropriato varierà a seconda delle diverse specie batteriche e con le analisi di follow-up desiderate.
   nota: Oltre all'utilizzo di terreno batterico per i controlli non infetti, altri controlli utili per alcune applicazioni di questa tecnica possono includere batteri uccisi dal calore o terreno batterico esaurito per il confronto.
7. Incubare le cellule infette a 37 °C con il 5% di CO₂.

4. Raccolta di campioni

1. Per raccogliere il terreno di coltura cellulare, i lisati delle cellule ospiti o i vetrini coprioggetti con cellule intatte per le analisi di follow-up, iniziare rimuovendo con cura l'inserto della membrana permeabile con una pinza sterile.
2. Per la valutazione delle proteine dell'ospite secrete:
   1. Raccogliere il terreno dalla camera inferiore in provette da 1,5 ml. Evitare di disturbare il monostrato durante la raccolta.
   2. Centrifugare i campioni a 14.000 rcf per 10 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari.
   3. Rimuovere tutto tranne 50 μl del surnatante in una provetta nuova da 1,5 ml e conservare a -20 °C o utilizzare immediatamente.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brodo Todd-Hewitt	Acumedia	7161A	Utilizzare brodo appropriato per le specie batteriche di interesse.
Biospettrometro	Eppendorf	Modello base	È adatto qualsiasi spettrofotometro UV-Vis.
Piastre di Petri	Fisher Scientifico	FB0875713	Altre marche sono adatte.
agar	sigma	A1296-1kg	Altre marche sono adatte.
HaCaT cheratinociti epiteliali umani			Dono dal laboratorio di Victor Nizet.
Medium dell'aquila modificata di Dulbecco (DMEM)	Tecnologie per la vita	Codice 11995-073	Utilizzare terreni appropriati per la linea cellulare di interesse.
Siero fetale bovino (FBS)	Bioovest	S162H	Utilizzare additivi appropriati per la linea cellulare di interesse.
Piastre per coltura tissutale da 10 cm	Nunc	Codice 150350	Altre marche sono adatte.
Piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti	CytoOne	cc7682-7506	Altre marche sono adatte, ma devono essere compatibili con l'inserto Corning.
Piastre per coltura tissutale a 24 pozzetti	CytoOne	cc7682-7524	Altre marche sono adatte, ma devono essere compatibili con l'inserto Corning.
Vetrini coprioggetti	Fisherbrand	12-541-B	Questi devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'uso per la placcatura delle celle.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco	Codice 10010-023
DMEM senza rosso fenolo	Tecnologie per la vita	31053028	I terreni privi di rosso fenolo sono necessari solo per il saggio di rilascio di LDH.
Albumina sierica bovina (BSA)	Fisher Scientifico	BP1600-100
L-glutammina	Gibco	25030149	Necessario solo per integrare i terreni di coltura cellulare per il test di rilascio di LDH.
Piruvato di sodio	Gibco	BP356100	Necessario solo per integrare i terreni di coltura cellulare per il test di rilascio di LDH.
Inserti Transwell da 0,4 μm rivestiti di collagene (6 pozzetti)	Corning	3540
Inserti Transwell da 0,4 μm rivestiti di collagene (24 pozzetti)	Corning	3595
forcipe	pescatore	3120018	Questi devono essere sterilizzati con etanolo prima di maneggiare gli inserti Transwell.
Raschiatori per celle	Fisherbrand	08-100-241	Questi sono necessari solo per la raccolta di lisati cellulari.