1. Coltura batterica
- Generare ceppi mutanti isogenici da utilizzare per lo studio dello specifico fattore secreto di interesse.
nota: I GASM1T1 5448 ceppi di Streptococcus utilizzati per questi esperimenti includevano WT GAS', un mutante sagAΔ cat SLS-deficiente (abbreviato nel testo come ΔsagA) e un ceppo complementato sagA (abbreviato nel testo come ΔsagA+sagA).
- Preparare colture liquide notturne di ceppi batterici di interesse. Coltivare i ceppi GAS M1T1 5448 in -10 ml di brodo Todd-Hewitt a 37°C per 16-20 ore prima di infettare le cellule umane.
- Centrifugare colture batteriche durante la notte (2.400 rcf per 10 minuti) e risospendere in terreno batterico fresco.
nota: La risospensione nello stesso volume in cui sono state coltivate le colture notturne (5-10 ml) produce generalmente una densità ottica iniziale desiderabile.
- Normalizzare le colture batteriche a concentrazioni iniziali uguali diluendo le colture ri-sospese in un terreno batterico aggiuntivo fino a ottenere la stessa densità ottica a 600 nm (OD600) per tutti i ceppi da testare (si consiglia OD600 di circa 1,0 per comodità).
nota: In questi studi, sono state utilizzate colture batteriche in fase stazionaria per infettare le cellule ospiti immediatamente dopo la normalizzazione. Tuttavia, poiché alcuni ceppi di batteri escono dalla fase stazionaria in modo non sincrono, potrebbe essere più appropriato iniziare le infezioni dell'ospite con colture in fase logaritmica se si scopre che questo è il caso per i ceppi di interesse.
- Prima di ulteriori analisi, eseguire un test di conteggio delle colonie per determinare le unità formanti colonie (CFU) per millilitro presenti nelle colture di partenza in modo da poter determinare la molteplicità dell'infezione (MOI) o il rapporto di batteri per cellula ospite.
- Preparare diluizioni seriali da 1 ml di colture batteriche che sono state normalizzate alla densità ottica desiderata in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o terreno di crescita batterica appropriato (in questi studi è stato utilizzato il brodo di Todd-Hewitt). Preparare diluizioni che vanno da 10-1 a 10-6 per produrre almeno una serie di piastre di agar con colonie numerabili (30-300 colonie). Eseguire tutte le diluizioni in triplice copia.
- Trasferire 100 μl di ciascuna diluizione seriale su una piastra di agar contenente il terreno appropriato per la specie batterica da analizzare.
nota: In questi studi è stato utilizzato l'agar Todd-Hewitt.
- Utilizzare uno spandiconcime batterico di vetro o di plastica per distribuire uniformemente l'aliquota da 100 μl su tutta la superficie della piastra di agar e continuare a spargere fino a quando il liquido non è stato assorbito nell'agar. Eseguire sotto fiamma utilizzando una tecnica sterile.
- Incubare le piastre di agar a 37°C per una notte o fino alla comparsa di innumerevoli colonie.
- Contare le colonie che crescono su ogni piastra e calcolare i CFU/ml nella coltura originale con la seguente formula: numero di colonie x inverso della diluizione seriale/volume di coltura impiattato in millilitri.
ad es. (200 colonie x 1/10-5 diluizione) / 0,1 ml placcato = 2,0 x 108 UFC/ml
2. Coltura cellulare ospite
- Ottenere una linea cellulare ospite appropriata per le analisi desiderate.
nota: Per questi studi sono stati utilizzati cheratinociti epiteliali umani HaCaT29, un gentile dono di V. Nizet.
- Mantenere le cellule HaCaT in piastre di coltura da 100 mm nel Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco con il 10% di siero fetale bovino (FBS) inattivato termicamente. Incubare a 37°C con il 5% di CO2.
3. Infezione della cellula ospite con sistema di inserti a membrana permeabile
- Piastra le cellule in apposite piastre di coltura tissutale e lasciale crescere fino a raggiungere il 90% di confluenza.
Nota: le cellule HaCaT utilizzate in questi studi raggiungono tipicamente la confluenza entro 2-3 giorni dalla piastra.
- Per la raccolta del lisato (ad es. analisi di segnalazione e saggi di determinazione dell'adenosina trifosfato (ATP)), piastrate le cellule HaCaT in piastre a 6 pozzetti a una densità di semina di circa 3 x 105 cellule/pozzetto.
- Per gli esperimenti di imaging in immunofluorescenza, le cellule vengono piastrate su vetrini di vetro sterili all'interno di piastre a 6 pozzetti con una densità di semina di circa 3 x 105 cellule/pozzetto.
- Per i saggi di permeabilizzazione della membrana dell'omodimero di etidio e di rilascio di lattato deidrogenasi (LDH), piastra le cellule HaCaT in piastre da 24 pozzetti a una densità di semina di circa 5 x 104 cellule/pozzetto.
- Immediatamente prima del trattamento, lavare le celle con 1x PBS sterile.
- Applicare un terreno di coltura fresco sulle cellule. Per le condizioni qui descritte, applicare 2 ml di terreno per pozzetto per piastre a 6 pozzetti o 0,5 ml di terreno per pozzetto per piastre a 24 pozzetti. Se sono in fase di sperimentazione trattamenti farmacologici, miscelare con terreno fresco e applicare durante questa fase.
nota: Alcuni saggi possono richiedere terreni alternativi. Ad esempio, poiché il rosso fenolo e le alte concentrazioni sieriche interferiscono con il saggio di rilascio dell'LDH, per questi esperimenti è stato utilizzato DMEM privo di fenolo integrato con albumina sierica bovina (BSA) all'1% (p/v), 2 mM di L-glutammina e 1 mM di piruvato di sodio.
- Dopo l'applicazione del terreno fresco, posizionare con cura un inserto a membrana permeabile sterile da 0,4 μm in ciascun pozzetto. Eseguire questo passaggio in una cappa a flusso laminare e utilizzare una pinza sterile per trasferire l'inserto della membrana permeabile in ciascun pozzetto.
- Applicare un terreno di coltura cellulare fresco nella camera superiore di ciascun pozzetto secondo le istruzioni del produttore. Per le condizioni qui descritte, applicare 1 ml di terreno per pozzetto per piastre a 6 pozzetti o 0,1 ml di terreno per pozzetto per piastre a 24 pozzetti.
- Applicare un volume appropriato di colture batteriche normalizzate (vedere paragrafo 1) nella camera superiore del sistema di inserti a membrana permeabile. Utilizzare un mezzo batterico per trattamenti di controllo non infetti. Per i risultati qui descritti, aggiungere 25 μl delle colture normalizzate per camera per piastre a 24 pozzetti e 100 μl delle colture per camera per piastre a 6 pozzetti.
Nota: In questi studi, il GAS wild-type o mutante è stato applicato alle cellule ospiti con un MOI di 10. Il MOI è stato calcolato sulla base del numero finale di cellule eucariotiche (ad es. 2 x 106 cellule/pozzetto), in modo tale che all'inizio del periodo di infezione siano stati aggiunti 10 volte più batteri per cellula ospite (ad es. 2 x 107 CFU per pozzetto). Il MOI appropriato varierà a seconda delle diverse specie batteriche e con le analisi di follow-up desiderate.
Nota: oltre all'utilizzo di terreno batterico per controlli non infetti, altri controlli utili per alcune applicazioni di questa tecnica possono includere batteri uccisi dal calore o terreno batterico esaurito per il confronto.
- Incubare le cellule infette a 37 °C con il 5% di CO2.
4. Raccolta di campioni
- Per raccogliere il terreno di coltura cellulare, i lisati delle cellule ospiti o i vetrini coprioggetti con cellule intatte per le analisi di follow-up, iniziare rimuovendo con cura l'inserto della membrana permeabile con una pinza sterile.
- Per la valutazione dei lisati delle cellule ospiti:
- Aspirare delicatamente il terreno sopra il monostrato di cellule ospiti. Evitare di disturbare il monostrato, in quanto ciò potrebbe causare la perdita di campione.
- Sciacquare le celle una volta con 1x PBS.
- Aspirare delicatamente il PBS. Applicare immediatamente un volume appropriato di tampone di lisi ghiacciato per ottenere la concentrazione proteica desiderata e incubare i campioni su ghiaccio per 15 minuti. Applicare tra 200 μl e 350 μl di tampone di lisi per pozzetto di ciascuna piastra a 6 pozzetti per ottenere concentrazioni proteiche comprese tra 0,5 e 1,5 mg/ml.
Nota: il tampone di lisi utilizzato in questi studi era composto da acqua deionizzata, sostituto Nonidet P40 all'1% (v/v), un cocktail di inibitori della fosfatasi e un cocktail di inibitori della proteasi. I reagenti specifici sono elencati nella sezione Materiali e attrezzature.
- Utilizzare un raschietto cellulare per staccare le cellule dalla superficie della piastra di ciascun pozzetto e pipettare l'intero contenuto di ciascun pozzetto in una provetta da 1,5 ml.
- Centrifugare i campioni a 14.000 rcf per 20 minuti a 4°C.
- Per valutare i componenti solubili del lisato, rimuovere il surnatante in una nuova provetta e conservarlo a -20°C o utilizzarlo immediatamente.
- Per valutare i componenti nucleari o altri componenti insolubili del lisato, riservare il pellet e conservarlo a -20°C o utilizzarlo immediatamente.
