Estrazione del lisato di cellule ospiti da cellule ospiti infette coltivate in un sistema a membrana permeabile

Abstract

Fonte: Flaherty, R. A., et al. Implementazione di un sistema di infezione basato su inserti di membrana permeabile per studiare gli effetti delle tossine batteriche secrete sulle cellule ospiti dei mammiferi. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video mostra un sistema di inserti a membrana permeabile per studiare l'impatto delle tossine batteriche sulle cellule ospiti in modo controllato e isolato. Questo approccio consente l'esposizione selettiva delle cellule alle tossine mantenendo una separazione fisica che imita la naturale interazione ospite-patogeno.

Protocollo

1. Coltura batterica

1. Generare ceppi mutanti isogenici da utilizzare per lo studio dello specifico fattore secreto di interesse.
   nota: I GASM1T1 5448 ceppi di Streptococcus utilizzati per questi esperimenti includevano WT GAS', un mutante sagAΔ cat SLS-deficiente (abbreviato nel testo come ΔsagA) e un ceppo complementato sagA (abbreviato nel testo come ΔsagA+sagA).
2. Preparare colture liquide notturne di ceppi batterici di interesse. Coltivare i ceppi GAS M1T1 5448 in -10 ml di brodo Todd-Hewitt a 37°C per 16-20 ore prima di infettare le cellule umane.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
HaCaT cheratinociti epiteliali umani			Dono dal laboratorio di Victor Nizet.
Medium dell'aquila modificata di Dulbecco (DMEM)	Tecnologie per la vita	Codice 11995-073	Utilizzare terreni appropriati per la linea cellulare di interesse.
Siero fetale bovino (FBS)	Bioovest	S162H	Utilizzare additivi appropriati per la linea cellulare di interesse.
Piastre per coltura tissutale da 10 cm	Nunc	Codice 150350	Altre marche sono adatte.
Piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti	CytoOne	cc7682-7506	Altre marche sono adatte, ma devono essere compatibili con l'inserto Corning.
Inserti Transwell da 0,4 μm rivestiti di collagene (6 pozzetti)	Corning	3540
Inserti Transwell da 0,4 μm rivestiti di collagene (24 pozzetti)	Corning	3595
Raschiatori per celle	Fisherbrand	08-100-241	Questi sono necessari solo per la raccolta di lisati cellulari.
Nonidet P40 Sostituto	sigma	74385-1L	Altri fornitori sono adatti.