Rilevamento dell'aderenza batterica alle cellule ospiti mediante imaging a fluorescenza

Abstract

Fonte: Yang, J., et al. Rilevamento automatizzato e ad alto rendimento dell'aderenza batterica alle cellule ospiti. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video dimostra il test di aderenza batterica per valutare l'aderenza batterica marcata con GFP alla coltura cellulare epiteliale per studiare la dinamica delle interazioni ospite-patogeno utilizzando l'imaging basato su microscopia a fluorescenza.

Protocollo

1. Aderenza batterica e colorazione della cellula ospite

1. Per prima cosa, lavare tre volte i monostrati di cellule A549 seminate con 1x PBS caldo. Per ogni lavaggio, aggiungere 100 μl di 1x PBS in ciascun pozzetto, pipettare delicatamente su e giù tre volte, smaltire 1x PBS o attendere 10 s dopo l'aggiunta, quindi aspirare per rimuovere 1x PBS. Per determinare la cinetica dell'associazione batterica, sovrapporre alle cellule 100 μL di concentrazioni desiderate di sospensione batterica con diversi MOI (0, 1, 10 e 100). Centrifugare i batteri a 200 x g per 10 minuti e incubare le cellule A549 infette a 37 °C, 5% di CO₂ per ulteriori 1 h.
   nota: In questo esperimento, ogni condizione aveva un triplicare tecnico.
2. Rimuovere i batteri non legati lavando i monostrati cinque volte con 1x PBS caldo come descritto sopra. Aggiungere 100 μl di formaldeide al 4% (in 1x PBS) in ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti per fissare le cellule. Lasciare riposare le piastre sul ghiaccio per 15 minuti e poi lavare via la soluzione di fissaggio usando 1x PBS tre volte.
3. Per colorare i nuclei, aggiungere 50 ng/mL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e incubarlo per 10 minuti a RT. Dopo l'incubazione, lavare i pozzetti tre volte utilizzando 1x PBS. Coprire le cellule A549 infette con 100 μl di 1x PBS per evitare che si secchino. Lavorare per il passaggio successivo o conservare la piastra a 4 °C per un massimo di 2 giorni al buio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10x PBS	VWR	45001-130
4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Thermo Fisher	Codice 62248	Colorante per colorazione su cellule ospiti
piastra a 96 pozzetti	Corning	3882	Metà area bene, fondo piatto e chiaro
Celle A549	ATCC	CCL 185	Linea cellulare di mammifero
centrifuga	Eppendorf	5810R
OD600 DiluPhotometro	IMPLEN
Brodo di soia tipico	Cellule di crescita	MBPE-4040
F-12k medio	ATCC	302004	Terreno di coltura cellulare A549
Siero fetale bovino	Corning	35-016-CV