Una tecnica di imaging per studiare la risposta al calcio nelle cellule infettate da batteri

Abstract

Fonte: Smail, Y., et al. Imaging Ca²⁺ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra una tecnica per rilevare la risposta locale e globale degli ioni calcio all'infezione da Shigella di cellule epiteliali umane. La shigella invade le cellule ospiti e rilascia effettori di invasione, influenzando i livelli di calcio intracellulare. L'ampiezza e la frequenza del calcio citosolico locale e globale sono studiate utilizzando un indicatore fluorescente.

Protocollo

1. Preparativi

1. Preparazione dei batteri
   1. Placcare i batteri, ceppo selvatico di Shigella che esprime l'adesina AfaE (M90T-AfaE), su una piastra di agar di soia tripticasica (TCS) contenente lo 0,01% di rosso Congo (CR) e incubarli per 18 ore a 37 °C.
      nota: Per aumentarne la riproducibilità, le piastre di Shigella ottenute al punto 1.1.1 vengono conservate a 4 °C e devono essere utilizzate entro una settimana perché tutte le colonie su terreno CR finiranno per diventare rosse nel tempo.
   2. Inoculare la pre-coltura del brodo TCS prelevando 3 colonie rosse dalle piastre di striature.
      nota: Viene eseguita un'inoculazione con 3 colonie per limitare la probabilità di scegliere un singolo clone il cui plasmide di virulenza ha subito una ricombinazione genetica.
   3. Coltivare colture batteriche liquide in un incubatore vibrante per 16 ore a 37 °C a 200 giri/min. Aggiungere ampicillina a una concentrazione finale di 75 mg/mL. Le concentrazioni di antibiotico non devono superare 3 volte la concentrazione inibitoria minima, poiché un eccesso di antibiotico può portare alla perdita del plasmide di grande virulenza.
      nota: Il mantenimento del plasmide di virulenza Shigella deve essere verificato mediante piastratura delle colture batteriche su piastre CR integrate con appropriate concentrazioni di antibiotici. La presenza di colonie bianche indica la perdita di plasmidi.
   4. Inoculare la coltura TCS con la precoltura batterica a una diluizione 1:100. Incubarlo a 37 °C in un'incubatrice agitante per 2 ore a 200 giri/min. Assicurarsi che la densità ottica a 600 nm (OD_600nm) sia 0,2 - 0,4.
   5. Centrifugare la coltura batterica per 2 minuti a 13.000 x g a 21 °C e risospendere il pellet in un volume equivalente di terreno EM (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgCl₂, 5 mM glucosio e 25 mM HEPES, pH = 7,3).
   6. Diluire la sospensione batterica in un tampone EM a un diametro esterno finale di_{600 nm} di 0,1 e utilizzarla immediatamente o conservarla a 21 °C e utilizzarla entro i successivi 60 minuti.
2. Preparazione delle cellule
   1. Coltivare cellule HeLa in DMEM con 1 g/L di glucosio integrato con il 10% di siero fetale di vitello (FCS) e farle crescere a 37 °C con il 10% di CO₂. Coltiva il TC-7 coltivato in DMEM con 4,5 g/L di glucosio, contenente il 10% di FCS e aminoacidi non essenziali in un incubatore a 37 °C contenente il 10% di CO₂.
   2. Per la manutenzione delle cellule, dividere le cellule regolarmente per evitare un'inibizione del contatto di crescita legata agli stati confluenti; questo è fondamentale per un'elevata efficienza di caricamento/trasfezione della sonda Ca²⁺.
   3. Piastra delle cellule HeLa su vetrini coprioggetti circolari sterili di 25 mm di diametro in piastre a 6 pozzetti a una densità di 3 x 10⁵ cellule/pozzetto il giorno prima dell'esperimento per le cellule HeLa.
   4. Per le cellule TC-7, tripsinizzare e contare le cellule. Seminarli a 4 x 10⁵ cellule/pozzetto e incubarli per 5 - 7 giorni a 37 °C in un incubatore al 10% di CO₂ prima degli esperimenti per consentire la polarizzazione.
      1. Rinfrescare il terreno di coltura cellulare ogni giorno fino al giorno dell'esperimento.
         nota: In alternativa ai pozzetti contenenti vetrini, possono essere utilizzate anche camere monouso con fondo in vetro da 35 mm di diametro. Se si utilizzano questi ultimi, il controllo della temperatura attraverso un tavolino o un obiettivo riscaldato non è sufficiente ed è necessaria una camera di incubazione termostatica montata sul tavolino del microscopio.
3. Il giorno dell'esperimento, rimuovere il terreno e lavare le cellule 3 volte con 1 mL di terreno EM a 21 °C.
4. Caricare le celle con 3 mM di Fluo-4/acetossimetilestere (Fluo-4-AM) in un tampone EM per 30 minuti a 21 °C.
   nota: Mentre il carico di celle HeLa sub-confluenti non solleva grossi problemi, il carico di celle TC-7 polarizzate è spesso eterogeneo e scarsamente efficiente. Per queste cellule, abbiamo scoperto che l'efficienza di carico è migliorata dall'aggiunta dell'agente disperdente, l'acido pluronico, a una concentrazione finale dello 0,1% e dell'inibitore del trasportatore anionico bromosulfoftaleina a una concentrazione finale di 20 μM all'EM contenente Fluo-4-AM. L'uso di sonde chimiche raziometriche o di sonde FRET geneticamente codificate che richiedono una doppia acquisizione non è compatibile con la velocità di acquisizione richiesta per l'imaging delle risposte locali al Ca²⁺.
5. Lavare i campioni 3 volte con tampone EM e incubarli ulteriormente in 1 mL di tampone EM a 21 °C per consentire l'idrolisi della porzione AM. Utilizzare le celle caricate con Fluo-4 immediatamente o entro i successivi 90 minuti (mantenute a 21 °C).

2. Infezione e acquisizione di immagini delle risposte locali al Ca²⁺

1. Posizionare il vetrino coprioggetti contenente le celle caricate con Fluo-4 in una camera di imaging o in una camera con fondo di vetro. Lavare i campioni nella camera di imaging o nella camera monouso con fondo di vetro 3 volte con tampone EM per rimuovere i composti potenzialmente derivanti dalla lisi cellulare. Aggiungere 1 mL di tampone EM.
2. Posizionare la camera su un tavolino per microscopio a fluorescenza invertita riscaldato a 33 °C.
   nota: Questa temperatura è selezionata come compromesso tra le temperature ottimali compatibili con il processo di invasione della Shigella e il rallentamento delle risposte del Ca²⁺ per visualizzare le risposte locali. Utilizziamo un obiettivo ad olio ad immersione 63X (NA = 1,25) dotato di anelli di contrasto di fase.
3. Seleziona un campo di microscopia e imposta i parametri di acquisizione, incluso il tempo di esposizione e il binning se necessario, per ottimizzare il segnale fluorescente Fluo-4.
   nota: Le principali sfide dell'imaging locale di Ca²⁺ sono la bassa ampiezza e la piccola durata delle risposte, che richiedono l'acquisizione almeno ogni 30 ms. Diversi dispositivi ad accoppiamento di carica con moltiplicazione di elettroni retroilluminati (EM-CCD) o semiconduttori di ossido di metallo complementare (C-MOS) disponibili in commercio presentano la sensibilità richiesta per rilevare le risposte locali di Ca²⁺ utilizzando Fluo-4. Anche la sensibilità di rilevamento è un problema importante per limitare il fotodanneggiamento o artefatti come le risposte spontanee legate all'eccitazione fluorescente di Fluo-4 ad alta frequenza. Qui, un'illuminazione basata su LED di 470 nm, con un filtro di eccitazione passa-banda da 480 ± 40 nm, un filtro dicroico da 505 nm e un'emissione passa-banda da 527 ± 30 nm utilizzata al 5% della sua intensità massima combinata con un filtro a densità neutra 1.0 sono stati utilizzati per ridurre al minimo questi problemi in un flusso di acquisizioni di durata limitata. È stata eseguita di routine un'analisi dei segnali locali di Ca²+ da lotti di flussi di 120 s. In queste condizioni di scarsa illuminazione, il fotobleaching con fluoroforo non è stato osservato durante le acquisizioni di 2 min-stream. È possibile eseguire acquisizioni successive sullo stesso campione, a condizione che vengano utilizzati campi diversi. Come regola generale, un primo flusso di acquisizione viene eseguito su un campo di controllo in assenza di stimolazione batterica per garantire l'assenza di risposte spontanee. Se si osservano risposte spontanee, i campioni vengono lavati con tampone EM fino a quando non si osservano risposte.
4. Per aggiungere batteri al campione, rimuovere 500 μL di tampone EM dalla camera e aggiungere 500 μL della sospensione batterica preparata al punto 1.1.6 per ottenere un OD finale di_600nm di 0,05, con la dovuta attenzione per evitare di spostare il campo di microscopia selezionato; i volumi garantiscono una corretta miscelazione dei batteri e una distribuzione omogenea dei batteri sui campioni cellulari.
5. Eseguire un'acquisizione dopo l'aggiunta batterica. In alternativa, eseguire un'acquisizione 10 minuti dopo l'aggiunta batterica, che corrisponde al tempo necessario ai batteri per sedimentare sulle cellule nelle condizioni utilizzate. Al termine del flusso di acquisizione, acquisire un'immagine a contrasto di fase del campo selezionato per visualizzare i batteri che entrano in contatto con le cellule e le increspature della membrana associate ai siti di invasione batterica.
6. Ripetere la procedura di acquisizione come al punto 2.5, a intervalli che siano in funzione della durata delle acquisizioni delle immagini, del salvataggio dei file e della selezione di un nuovo campo per coprire l'intero processo.
   Nota: Per Shigella, abbiamo scoperto che i flussi di acquisizione ogni 5 minuti per 20 minuti, dopo i 10 minuti di sedimentazione batterica, hanno permesso di coprire la maggior parte degli eventi di invasione.
7. Al termine della procedura di acquisizione, aggiungere una concentrazione finale di 2 μM dei campioni di ionomicina ionoforica Ca²⁺ per determinare l'ampiezza massima dei segnali Ca²⁺. Acquisire immagini ogni 3 - 5 s fino alla stabilizzazione del segnale, di solito per meno di 10 minuti.
8. Seguire aggiungendo il chelante Ca²⁺ glicole etilenico-bis(β-amminoetiletere)-N, N, N', N'-acido tetraacetico (EGTA) a una concentrazione finale di 10 mM per determinare il segnale di fluorescenza in assenza di Ca²⁺. Acquisire immagini ogni 3 - 5 s fino alla stabilizzazione del segnale, di solito per meno di 10 min.
   nota: A causa della dinamica relativamente lenta delle variazioni globali di Ca²⁺, eseguire queste acquisizioni ogni 3 - 5 s (non in modalità streaming), consentendo l'imaging di Ca²⁺ sullo stesso campo microscopico durante i trattamenti successivi.

3. Analisi

1. Esprimere le variazioni citosoliche del Ca²⁺ nel tempo come percentuale di ΔF/F0, dove ΔF rappresenta la variazione dell'intensità media di fluorescenza della regione di interesse (ROI) e F0 la fluorescenza basale nella stessa ROI, a cui viene sottratta una regione non rilevante del campo priva di cellule.
   1. Rimuovere i livelli di fluorescenza basale per ogni cellula in campi diversi, corrispondenti ai livelli basali; questi livelli possono essere determinati in modo inequivocabile a causa della bassa frequenza e della durata relativamente breve delle risposte locali di Ca²⁺ in una data acquisizione di flusso><. Nota: Quantificare le caratteristiche sorprendenti delle risposte relative alle domande poste e al modello patogeno studiato. Classicamente, vengono presi in considerazione vari parametri per analizzare i segnali del Ca²⁺, tra cui la frequenza delle celle che mostrano risposte locali o globali del Ca²⁺, nonché la durata, l'ampiezza e la frequenza di queste risposte. Nel caso della Shigella e delle risposte locali, un altro aspetto importante dell'analisi è l'associazione spaziale delle risposte con i siti di invasione batterica.
2. Per quantificare la percentuale di cellule responsive che mostrano risposte globali o locali, disegnare le ROI nelle celle, in serie temporali corrispondenti alle variazioni di intensità di Fluo-4.
   1. Impostare parametri rigorosi per identificare le risposte locali al Ca²⁺, come un'ampiezza di tre volte superiore alle variazioni di fondo della linea di base media dell'intensità di fluorescenza delle cellule, o una durata di almeno 200 ms, per evitare di ottenere un falso positivo.
      nota: Come regola generale, anche piccole risposte locali di Ca²⁺ possono essere distinte da qualsiasi rumore di fondo in base al loro profilo. Le ROI dovrebbero essere sufficientemente grandi da integrare un numero sufficiente di segnali di fluorescenza per consentire il rilevamento di variazioni locali. A seconda dell'intensità della rivelazione del Fluo-4, queste ROI possono corrispondere a cerchi con diametri compresi tra 2 e 5 mM.
   2. Misurare le variazioni dell'intensità media di fluorescenza Fluo-4 in 2 regioni in un'area distinta della stessa cella, per determinare se le risposte sono locali o globali.
      nota: L'analisi di un gran numero di cellule è facilitata dall'uso di software di imaging che consentono la visualizzazione online su schermo delle variazioni dell'intensità media di fluorescenza nel tempo per le regioni selezionate. Il software di imaging disponibile in commercio ha questa opzione, ma questa può essere eseguita anche utilizzando il freeware Icy, utilizzando il plug-in ROI Intensity Evolution.
   3. Determinare la percentuale di celle che mostrano risposte locali.
      nota: Questa percentuale è calcolata dal numero totale di cellule analizzate nel campo della microscopia, che dovrebbe essere in numero sufficiente per supportare una significatività statistica utilizzando un test non parametrico.
   4. Determinare la durata delle risposte locali.
      nota: Le risposte locali al Ca²⁺ possono essere ulteriormente distinte in base ai loro intervalli di durata (cioè inferiori a 500 ms, tra 5 e 10 s, o superiori a 10 s) e alla loro associazione con i siti di invasione di Shigella.
3. Quantificare l'ampiezza delle risposte. Innanzitutto, calibrare i livelli massimi di Ca²⁺ e di fondo cellulare determinati al punto 2.1.7. Poiché il carico di Fluo-4 può variare per ogni cella, eseguire queste determinazioni per le singole celle sul campo.
   1. Esprimere l'ampiezza delle risposte come percentuale relativa della risposta massima.
   2. Eseguire test statistici utilizzando un test di normalità, seguito da un test parametrico per analizzare le potenziali differenze nell'ampiezza delle risposte tra i campioni.
   3. Determinare l'associazione di queste risposte relative ai siti di invasione batterica mediante la loro rispettiva localizzazione alle increspature della membrana indotte dai batteri visualizzate nelle corrispondenti immagini a contrasto di fase.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph versione 7.7	Imaging universale
Sistema di illuminazione CoolLED pE-2	Roper Scientifico
Micro-piatto 35 mm, alto	IBIDI	Codice 81156
Brodo di soia tripticasica (TCS)	Thermofisher	B11768
TCS agar	Thermofisher	B11043
Rosso Congo	Sigma-Aldrich	Codice 75768
M90T-AFAE	Sun et al. 2017		Shigella flexneri sierotipo V. che esprime l'adesina AfaE
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017		Ceppo isogenico mutante ipgD che esprime l'adesina AfaE