Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione dei Pan-leucociti
- Prelevare 1 mL di sangue periferico da un donatore sano (o paziente) in una siringa eparinizzata. Assicurati di avere l'approvazione del comitato etico competente per la donazione di sangue.
- Miscelare 1 mL di sangue periferico umano con 30 mL di tampone di lisi ACK (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3 e 0,1 mM EDTA, pH 7,0) in una provetta da 50 mL e incubare per 8 minuti a temperatura ambiente.
- Riempire le provette con PBS e centrifugare a 300 x g per 6 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 30 mL di tampone di lisi ACK.
- Ripetere i passaggi 1.2 e 1.3 fino a quando il surnatante non è limpido. Infine, lavare le cellule in PBS, centrifugare a 300 x g per 6 minuti a temperatura ambiente e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno di coltura (RPMI1640 + 10% FCS). Incubare le cellule a 37 °C per 60 minuti.
2. Caricamento delle celle Raji con SEB
- Preparare due provette Falcon da 15 mL con 1,5 x 10 6 cellule Raji per provetta. Centrifugare le celle (300 x g per 6 minuti a temperatura ambiente) e scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule nel terreno residuo (circa 50-100 μL), aggiungere 1,9 μL (1,9 μG) di SEB e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Aggiungere 5 mL di terreno di coltura, centrifugare le cellule (300 x g per 6 minuti a temperatura ambiente) e risospendere il pellet nel terreno di coltura (RPMI1640 + 10% FCS) a una densità di 1 x 106 cellule/mL.
3. Induzione delle sinapsi immunitarie e protocollo di colorazione
- Pipettare 500 μl della preparazione di cellule Raji caricate con SEB in una provetta FACS e 500 μl della preparazione di cellule Raji scariche in un'altra provetta FACS. Aggiungere 650 μl di pan-leucociti a ciascuna provetta e centrifugare le cellule (300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente). Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 150 μl di terreno di coltura (RPMI1640 + 10% FCS). Incubare a 37 °C (tipicamente per 45 minuti).
- Agitare delicatamente le cellule (10 s a 1.000 giri/min) e aggiungere 1,5 ml di paraformaldeide (1,5%) durante il vortice per fissare le cellule. Arrestare la fissazione aggiungendo 1 mL di PBS + 1% BSA. Pellettare le cellule (300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS + 1% BSA dopo l'incubazione a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Pellettare (300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente) e risospendere le cellule in 100 μL di PBS + 1% BSA + 0,1% saponina per 15 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzare le cellule (piastra a 96 pozzetti, a forma di U).
- Lavare le cellule in PBS + 1% BSA + 0,1% saponina con centrifugazione (300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente) e risospendere il pellet cellulare in 50 μl di PBS + 1% BSA + 0,1% saponina contenente anticorpi o composti marcati con fluorofori (CD3-PE-TxRed (1:30), falloidina-AF647 (1:150) e DAPI (1:3.000)).
- Incubare le cellule a temperatura ambiente al buio per 30 minuti. Lavare le cellule 3 volte aggiungendo 1 mL di PBS + 1% BSA + 0,1% di saponina. Centrifugare a 300 x g per 10 min a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in 60 μL di PBS per la citometria a flusso di imaging.
4. Acquisizione di immagini utilizzando un citometro a flusso
NOTA: La seguente procedura di acquisizione delle immagini e l'analisi dei dati si basano sulla citometria a flusso di imaging utilizzando software come imagestream (IS100), INSPIRE e IDEAS. Tuttavia, è possibile utilizzare anche altri citometri a flusso e software di analisi.
- Aprire il software di analisi sul computer collegato al citometro a flusso per immagini e fare clic su Inizializza fluidica nel menu Strumento. Applicare le perline sulla porta destra quando richiesto.
- Caricare il modello predefinito dal menu File e fare clic su Esegui/Configura. Scegli Perline dal menu a discesa Visualizza.
- Regolare l'illuminatore a campo chiaro facendo clic su Imposta intensità se il valore indicato è inferiore a 200.
- Eseguire la routine di calibrazione e test nella scheda Assist facendo clic su Avvia tutto.
- Fare clic su Flush/Lock/Load e applicare gli esempi nella porta sinistra quando richiesto. Dopo aver caricato le cellule nel citometro a flusso, aprire il classificatore di celle e regolare i valori come segue: limite superiore dell'intensità di picco a 1.022 per ciascun canale, limite inferiore dell'intensità di picco a 50 per il canale 2 (DAPI) e il canale 5 (CD3-Pe-TxR), limite inferiore dell'area a 50 per il canale 1 (diffusione laterale) e limite superiore a 1.500.
- Modificare la potenza del laser di eccitazione a 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) e 647 nm (90 mW) nella scheda Configurazione.
- Cambia il menu a discesa Visualizza tra Celle e Perline per valutare le regolazioni del classificatore di celle e della potenza del laser.
nota: Assicurarsi che tutte le cellule e le coppie di cellule si trovino nella Vista celle e che i grumi cellulari, i detriti e le immagini con pixel saturi si trovino nella Vista detriti modificando i classificatori cellulari e/o i poteri del laser di eccitazione.
- Definire il nome del campione e il numero di immagini da acquisire (15.000-25.000 per i campioni e 500 per i controlli di compensazione) nella scheda Configurazione. Fare clic su Esegui/Imposta per avviare l'acquisizione.
