Un test per studiare la regolazione della fagocitosi dei macrofagi da parte delle cellule staminali mesenchimali

Abstract

Fonte: Evans, J. F., et al. Regolazione delle cellule staminali mesenchimali della fagocitosi dei macrofagi; Quantificazione e imaging. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra un test per studiare la regolazione della fagocitosi dei macrofagi da parte delle cellule staminali mesenchimali (MSC) in una co-coltura. Dopo la co-coltura di MSC con macrofagi, vengono aggiunte particelle di zimoso non opsonizzate coniugate a un fluoroforo sensibile al pH che vengono fagocitate dai macrofagi. Con l'aumento della fagocitosi, l'intensità della fluorescenza aumenta, consentendo la determinazione della regolazione dell'attività fagocitaria mediata dalle MSC.

Protocollo

NOTA: Tutte le tecniche di preparazione del terreno e di coltura cellulare vengono eseguite in condizioni asettiche utilizzando una cappa di biosicurezza a flusso laminare. Tutte le fasi di incubazione della coltura descritte vengono eseguite utilizzando un incubatore progettato per mantenere un'atmosfera di 37 °C, 5% di CO₂ e 95% di umidità.

1. Coltura cellulare

1. Preparazione del terreno di coltura
   1. Per le MSC (cellule staminali mesenchimali) e LADMAC (macrofagi derivati dal midollo osseo di topo; deriva dai nomi dei ricercatori che hanno creato la linea cellulare: Laskin, Dower e Malech), aggiungere 50 ml di FBS e 5 ml di miscela antibiotico/antimicotica 100x a 500 ml di DMEM ad alto glucosio (terreno Eagle modificato di Dulbecco).
   2. Per i macrofagi (MΦ), aggiungere 50 mL di FBS, 100 mL di terreno di condizione LADMAC (preparato seguendo i passaggi del paragrafo 1.2) e 5 mL di miscela antibiotica 100x a 500 mL di DMEM.
      ad alto glucosio nota: Le cellule LADMAC producono il fattore stimolante le colonie (CSF-1) necessario per supportare la crescita delle cellule MΦ.
2. Propagare le cellule in preparazione per la co-coltura
   1. Per seminare le cellule MSC e MΦ dal ceppo congelato, equilibrare 9 mL di terreno di crescita appropriato preparato nella sezione 1.1 in ciascuna delle quattro piastre trattate con colture cellulari da 100 mm per ciascun tipo di cellula e metterle nell'incubatore per colture cellulari per 15 minuti.
   2. Nel frattempo, scongelare rapidamente le aliquote di 10⁶ cellule congelate incubandole in un bagno d'acqua a 37 °C per 2-3 minuti o fino a quando non sono appena scongelate. Quindi, aggiungere le cellule MSC scongelate a 9 mL di terreno di crescita MSC fresco e aggiungere le cellule MΦ scongelate a 9 mL di terreno di crescita MΦ fresco in provette coniche sterili da 15 o 50 mL e centrifugare a 125 x g in un rotore a secchiello oscillante per 5 minuti.
   3. Aspirare o decantare il surnatante e risospendere ogni pellet in 4 mL del terreno di crescita fresco appropriato pipettando delicatamente su e giù. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare a ciascuna delle quattro piastre da 100 mm per ciascun tipo di cellula che sono state equilibrate al punto 1.2.1.
   4. Rimetti le piastre con le cellule nell'incubatrice. Cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni fino al 70%-80% confluente.

2. Semina MSC in piatti sperimentali, Giorno 1

NOTA: Prima di seminare l'MSC, progetta il layout sperimentale della piastra a 96 pozzetti per la spettrofotometria fluorescente e il vetrino della camera per l'imaging dinamico. Per la piastra a 96 pozzetti, affiancare i pozzetti sperimentali con pozzetti contenenti cellule, ma non utilizzarli nel saggio. Contrassegnare almeno quattro pozzetti da utilizzare per il bianco del reagente (RBL). Vedere la Tabella 1 per un esempio di modello a 96 pozzetti e la Tabella 2 per un esempio di modello di vetrino a camera a 4 pozzetti. Si consigliano piastre nere o bianche a 96 pozzetti con fondo trasparente. Un vetrino da camera in vetro borosilicato da 1,5 mm è ottimale, ma il numero di camere può essere regolato a seconda del disegno dello studio. Nella Figura 1 è incluso un diagramma di flusso riassuntivo dei metodi che seguono.

1. Alla confluenza del 70%-80%, aspirare il terreno di coltura dalle colture in piastre da 100 mm e aggiungere 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per isolare le MSC.
2. Aspirare il PBS, aggiungere 2 ml di tripsina/EDTA allo 0,05% (acido etilendiamminotetraacetico) e metterlo nell'incubatore di coltura per 3-5 minuti.
3. Dopo 3 minuti, controllare il distacco delle cellule utilizzando un microscopio invertito. Se le celle sono staccate, continuare con il passaggio successivo; In caso contrario, continuare l'incubazione per altri 1-2 minuti. Non incubare per più di 5-6 minuti.
4. Aggiungere 5 ml di terreno di coltura fresco al piatto con le cellule staccate. Sciacquare la capsula con la miscela tripsina/terreno e raccogliere le cellule in una provetta conica da 50 mL pulita e sterile utilizzando una pipetta sierologica sterile.
5. Centrifugare per 5 min a 125 x g. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di crescita fresco pipettando delicatamente su e giù.
6. Per contare le cellule, aggiungere 10 μl di sospensione cellulare a 30 μl di soluzione di blu di tripano allo 0,4% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Quindi, pipettare 10 μl della miscela sotto il vetrino coprioggetto di una camera di conteggio dell'emocitometro.
7. Utilizzando un microscopio invertito o a campo chiaro, con l'obiettivo 10x, contare le cellule non colorate (vitali) in quattro dei quadrati da 1 mm². Calcolare il numero di cellule utilizzando la formula: cellule/mL = conta cellulare/# 1 mm² quadrati x fattore di diluizione x 10⁴.
   nota: Per questo esempio, il numero di quadrati da 1 mm² contati è quattro e il fattore di diluizione è 4.
8. Utilizzare l'equazione C₁V₁ = C₂V₂ per calcolare e preparare una sospensione 1 x 10⁵ celle/mL. Preparare 1 mL di cellule/mL di sospensione per ogni colonna della piastra a 96 pozzetti da riempire e 0,75 mL per ogni camera del vetrino a 4 pozzetti da riempire secondo il design della piastra.
   nota: C₁ = conteggio delle cellule, V₁ = ciò che viene calcolato, C₂ = 1 x 10⁵, V₂ = 5,50 mL.
9. Determinare V₁ e sottrarlo dai 5,50 mL desiderati del volume totale per determinare il volume del terreno fresco necessario per preparare la sospensione. Aggiungere il volume di cellule (V₁) della sospensione originale al volume di terreno fresco per un totale di 5,50 mL con 1 x 10⁵ cellule/mL.
10. Aggiungere 100 μl di sospensione 1 x 10⁵ cellule/mL a ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti secondo il design della piastra utilizzando un micropipettatore multicanale e 530 μl a ciascuno dei pozzetti del vetrino della camera utilizzando una micropipetta secondo il design della piastra. Incubare durante la notte.
    nota: Per questo esperimento, le MSC sono piastrate nelle colonne 1, 2, 3 e 6 della piastra a 96 pozzetti (Tabella 1) e nei pozzetti 1 e 2 del vetrino della camera a 4 pozzetti (Tabella 2). Pertanto, vengono preparati almeno 5,50 mL di una sospensione 1 x 10^{a 5} celle/mL. La MΦ all'80% di confluenza viene trattata con mediatori dell'infiammazione lo stesso giorno in cui le MSC vengono seminate nelle piastre sperimentali.

3. Isolare il MΦ e preparare le co-colture, Giorno 2

1. Rimuovere il mezzo di attivazione dalle cellule MΦ e sostituirlo con 5 ml di terreno di crescita fresco. Raschiare delicatamente con un sollevatore di cellule e raccogliere le cellule in una provetta conica da 50 mL.
2. Contare le cellule utilizzando l'esclusione del blu di tripano e l'emocitometria come descritto per le MSC nei passaggi 2.6-2.7.
3. Utilizzando l'equazione dei passaggi 2.8-2.9, preparare due sospensioni separate di 2 x 10⁵ cellule/mL, una con le cellule del controllo e una con le cellule delle colture di MΦ trattate.
   nota: Preparare 1 mL di cellula/mL di sospensione per ogni colonna della piastra a 96 pozzetti da riempire e 0,75 mL per ogni camera del vetrino a 4 pozzetti da riempire secondo il design della piastra.
4. Aspirare delicatamente il terreno dai pozzetti sperimentali della piastra a 96 pozzetti contenente MSC. Utilizzando una micropipetta multicanale, aggiungere 100 μl delle sospensioni cellulari MΦ trattate e di controllo nei pozzetti sperimentali appropriati con e senza MSC secondo il design della piastra. Incubare per una notte.
5. Aspirare delicatamente il terreno dal vetrino della camera a 4 pozzetti contenente MSC e, utilizzando una micropipetta, aggiungere 530 μl di sospensione cellulare MΦ nei pozzetti appropriati secondo il progetto. Incubare per una notte.

4. Saggio di fagocitosi, lettura cinetica fluorescente su piastra a 96 pozzetti, Giorno 3

1. Impostazione dei parametri del test
   1. Il giorno del test, accendere il lettore di piastre fluorescenti e impostare la temperatura del sistema a 37 °C dal computer.
   2. Aprire il software System Pro e controllare l'icona dello strumento nell'angolo in alto a sinistra per determinare se lo strumento è collegato al computer. Se è visibile il cerchio rosso con una linea, fare clic sull'icona dello strumento e scegliere lo strumento nella finestra pop-up per effettuare la connessione.
   3. Seleziona Nuovo esperimento per accedere alla finestra popup dell'helper per la configurazione delle lastre. Dal menu Plate Set-Up Helper, selezionare Configura le impostazioni di acquisizione.
   4. Selezionare Monocromatore dal menu delle impostazioni per la configurazione ottica. Selezionare FL (fluorescenza) per la modalità di lettura e Cinetica per il tipo di lettura.
   5. Nella stessa finestra di configurazione, in Categoria, fare clic su Lunghezze d'onda, quindi impostare le larghezze di banda su 9 nm per l'eccitazione e 15 nm per l'emissione.
   6. Impostare il numero di coppie di lunghezze d'onda su 1. Impostare le lunghezze d'onda LM1 a 510 nm per l'eccitazione e a 540 nm per l'emissione.
   7. Continua tra le categorie e seleziona Tipo di targa. Selezionare l'opzione che corrisponde al tipo di piastra in uso.
      nota: È importante che la selezione corrisponda al tipo di targa. Le altezze di lettura vengono impostate dal sistema in base alla selezione.
   8. Quindi, selezionare Area di lettura ed evidenziare l'area della piastra a 96 pozzetti inclusa nel progetto sperimentale.
   9. Selezionare PMT e ottica, impostare il guadagno PMT su alto e i lampeggi per lettura su 6. Selezionare la casella accanto a Leggi dal basso se si utilizza una piastra a fondo trasparente.
   10. Selezionare Cronometraggio e impostare intervalli di 10 minuti su un periodo di 70 minuti.
   11. Seleziona Agita, seleziona la casella Prima della prima lettura e impostala per 5 secondi. Seleziona la casella Tra le letture e impostala per 3 secondi. Imposta l'intensità della vibrazione sia su Bassa che su Lineare.
   12. Chiudi la finestra. Quando viene visualizzata la finestra Assistente per la configurazione delle lastre, selezionare Configura il layout delle piastre. Evidenzia i pozzetti BL del design della piastra e fai clic su Plate Blank.
   13. Evidenzia ciascuna delle righe sperimentali, fai clic su Aggiungi, assegna un nome al gruppo, quindi seleziona un colore.
   14. In Opzioni di assegnazione sotto il design della targa, selezionare Serie, quindi definire la serie nella finestra e fare clic su OK. Ripetere l'operazione per ogni gruppo.
2. Preparare la sospensione di zymosan
   1. In attesa che la temperatura del sistema raggiunga i 37 °C, risospendere 1 mg di particelle di zimoso in 5 mL di terreno di imaging su cellule vive.
      1. Aggiungere 1 mL di terreno di imaging su cellule vive alla fiala contenente le particelle e raccoglierle in una provetta di vetro. Sciacquare il flaconcino con un ulteriore 1 mL di soluzione per imaging e trasferirlo nella stessa provetta di vetro per assicurarsi che tutte le particelle vengano trasferite. Aggiungere 3 mL di soluzione di imaging aggiuntiva per ottenere una sospensione di particelle di 0,2 mg/mL.
   2. Vortice con impulsi rapidi per 30-60 s. Quindi, utilizzare un sonicatore a sonda per sonicare con 60 impulsi rapidi.
      nota: È molto importante creare una sospensione omogenea di particelle e non lasciare che la sospensione rimanga troppo a lungo prima di aggiungerla ai pozzetti sperimentali. L'aggregazione si ripresenta rapidamente. Potrebbe essere necessario ottimizzare la densità delle particelle per cella a seconda della fonte, del trattamento e della densità di MΦ utilizzata. Negli studi presentati sono state utilizzate particelle di zimoso coniugate. Tuttavia, sono disponibili anche E. coli coniugati e S. aureus.
3. Aggiungere lo zimoso e leggere la targhetta
   1. Aspirare il terreno dai pozzetti sperimentali e risciacquare 1 volta con 100 μl della soluzione di imaging di cellule vive. Sciacquare anche i pozzetti RBL con la soluzione di imaging di cellule vive.
   2. Aspirare la soluzione di imaging di cellule vive dai pozzetti sperimentali e RBL e sostituirla con 100 μL di sospensione di particelle di zimosano.
   3. Aprire il vassoio delle lastre del lettore fluorescente utilizzando l'interfaccia touchpad. Posizionare il piatto, senza coperchio, nella teglia con il pozzetto A1 nell'angolo in alto a sinistra. Chiudere la barra utilizzando il touchpad e fare clic sul pulsante verde Leggi nel menu in alto.
   4. Al termine della lettura, salvare il file nella cartella appropriata ed esportare i dati in formato foglio di calcolo facendo clic su File e selezionando Esporta.
   5. Calcolare la fluorescenza relativa media ± SEM per ciascun gruppo replicato in ogni punto temporale (10 min, 20 min, 30 min, ecc.) nel foglio di calcolo (File supplementare 1) e trasferire i dati al software grafico.
   6. Utilizzare un grafico a linee per presentare i dati e applicare l'ANOVA a due vie (Time x Treatment/MSC as factors) seguita dal test di confronto multiplo di Tukey per determinare le differenze tra i singoli gruppi.
      nota: Mentre è in corso la lettura della piastra a 96 pozzetti, preparare la piastra di imaging dinamico per l'acquisizione dell'immagine in time-lapse. Assicurarsi che l'imaging dinamico proceda con l'analisi di un pozzetto sperimentale alla volta.

Tabella 1: Esempio di un progetto di piastra a 96 pozzetti. CBL - Cella vuota; MSC - testa di serie 1° giorno; MΦ+ trattato e MΦ non trattato seminato giorno 2; Vuoto di reagente RBL aggiunto il giorno 3 del saggio.

	1	numero arabo	3	4	5	6	7
un	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
E	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
E	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
D	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
E	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
E	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
E	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
H	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL

Tabella 2: Esempio di un design di vetrino a camera a 4 pozzetti. MSC - placcato giorno 1; MΦ+ trattato e MΦ non trattato placcato giorno 2.

1	numero arabo	3	4
MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+

Risultati

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro del saggio di co-coltura e fagocitosi. Cenni al flusso di lavoro per l'analisi quantitativa e qualitativa dell'attività di fagocitosi MΦ in co-coltura con MSC.

File supplementare 1: Un file di foglio di calcolo rappresentativo di dati cinetici grezzi da un esperimento ottimale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Micropiastra in polistirene nero a 96 pozzetti	MilliporeSigma	CLS3603-48EA
Soluzione di blu di tripano allo 0,4%	MilliporeSigma	T8154-20ML
Provette da centrifuga sterili coniche in polipropilene da 15 mL e 50 mL	ThermoFisher	339653
Antibiotico-Antimicotico (100X) Gibco	ThermoFisher	15240096
Sollevatore di celle	MilliporeSigma	CLS3008-100EA
Palloni di coltura, trattati con coltura tissutale, superficie 75 cm2, collo inclinato, con tappo, filtrati	MilliporeSigma	C7231-120EA
D1 ORL UVA [D1]	ATCC	Codice CRL-12424	Linea cellulare MSC di topo
DMEM, alto glucosio	ThermoFisher	11965092
Siero fetale bovino, qualificato, inattivato a caldo	ThermoFisher	16140071
Emocitometro	FisherScientific	02-671-51B
I-11.15	ATCC	Codice CRL-2470	Linea cellulare MΦ di topo
Linea cellulare LADMAC	ATCC	CRL-2420	Le cellule LADMAC secernono il fattore stimolante le colonie 1 (CSF-1) del fattore di crescita.
Soluzione di imaging di cellule vive	ThermoFisher	A14291DJ
PBS, pH 7,4	ThermoFisher	10010031
pH Rhodo Green Zymosan Bioparticelle coniugato	ThermoFisher	P35365
Spectramax i3X	Dispositivi molecolari
Unità filtranti sottovuoto monouso sterili, 250 mL, 0,2 μm	ThermoFisher	568-0020
Filtri per siringhe sterili, 0,2 micrometri	ThermoFisher	723-2520
Piastre di coltura trattate con coltura tissutale, 100 mm x 20 mm	MilliporeSigma	CLS430167-100EA
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo	ThermoFisher	25300054