Una varietà di fattori di crescita e proteine interagiscono per indurre le cellule ad assumere diversi destini delle cellule durante lo sviluppo. Qui mostriamo l'uso di un ovo in preparazione per affrontare le possibili interazioni tra proteine diverse nello sviluppo, ponendo le perle di E2.5 embrioni di pollo.
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Articolo metodologico
Posizionamento Growth Factor-Coated Perline su embrioni di pollo Stadio
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il tubo neurale esprime molte proteine in specifici modelli di spazio-temporale durante lo sviluppo. Queste proteine hanno dimostrato di essere critica per la determinazione del fato cellulare, la migrazione delle cellule e la formazione dei circuiti neurali. Induzione neuronale e patterning coinvolgere proteina morfogenetica dell'osso (BMP), Sonic hedgehog (SHH), fattore di crescita dei fibroblasti (FGF), tra gli altri. In particolare, il pattern di espressione di Fgf8 è in prossimità di regioni che esprimono BMP4 e SHH. Questo pattern di espressione è coerente con le interazioni di sviluppo che facilitano patterning nel telencefalo.
Qui forniamo una dimostrazione visiva di un metodo in cui un ovo in preparazione può essere usato per testare gli effetti del fgfs nella formazione del prosencefalo. Perle sono rivestiti con proteine e messo nel tubo neurale sviluppo per fornire l'esposizione prolungata. Poiché la procedura utilizza piccoli, perline accuratamente posizionati, è minimamente invasivo e permette sfere diverse da collocare all'interno di un unico tubo neurale. Inoltre, il metodo permette di sviluppo in modo che gli embrioni possono essere analizzati in una fase più matura per rilevare i cambiamenti di anatomia e di patterning neurale. Questo protocollo permette di semplice ma utile per l'imaging in tempo reale. Esso fornisce un mezzo per rendere spazialmente e temporalmente limitate modifiche a livelli di proteine endogene.
Protocollo
1. Rimuovere le uova dal incubatore
A E2-2.5 (~ S. 17 HH), togliere le uova e preparare di conseguenza. Possono essere lavorato immediatamente o restituite al incubatore per un paio d'ore. Le uova possono essere messi a temperatura ambiente sicuro per più di un'ora. Uova possono rimanere fuori per tutta la durata delle manipolazioni. A volte questi può richiedere un'ora o più.
Nota: il più a lungo a temperatura ambiente, meno è probabile che per sopravvivere.
2. Preparazione di china
- Preparare una soluzione fresca del 4% di inchiostro in India nel PBS st....
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Discussione
A seconda delle proteine che si desidera utilizzare, ci sono diversi protocolli su come preparare le perline. In questi esperimenti, si usa eparina-acrilico perline, ma affi-gel sfere possono anche essere utilizzati. Abbiamo scoperto che l'eparina-acrilico perle sono più facili da manipolare in ambiente acquoso del ovoalbumina. Le perline vengono immersi in 5 l di proteine durante la notte a 4 ° C. Microsfere di controllo sono posti in PBS sterile fino al momento del collocamento. Il vantaggio nell'utilizzo di uno in preparazion.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Uova | Animale | Fecondate, E2-2,5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubatrice | Profi-I | Lyon | ||
| Inchiostro di India | Strumento | Higgins | Preparare una soluzione al 4% in PBS sterile. | |
| PBS sterile | In alternativa, può essere utilizzata una miscela di anticorpi | |||
| Siringa da 1 ml | ||||
| Aghi 27G 1/2 | Strumento | BD Biosciences | 305109 | Inclinati a 90 gradi |
| Pinzette | Strumento | World Precision Instruments, Inc. | misura 55 | |
| Pinze emostatiche | ||||
| Forbici da dissezione | Strumento | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8,5 cm |
| Nastro in parafilm | per sigillare le uova | |||
| Provetta al tungsteno | Strumento | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Strumento n. 24. L'impugnatura è opzionale. |
Riferimenti
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L.
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Ristampe e permessi
