Produzione e purificazione di anticorpi ricombinanti da cellule di mammifero

Abstract

Fonte: Shivange, Gururaj, et al. Analisi della distribuzione tumorale e tissutale dell'anticorpo terapeutico antigene-specifico bersaglio. (2020).

Il video spiega il processo di produzione di anticorpi nelle cellule ospiti dei mammiferi, dall'espressione genica alla secrezione. Coinvolge la trascrizione, la traduzione, il riconoscimento del segnale, il corretto ripiegamento e l'eventuale rilascio nel mezzo extracellulare tramite vescicole secretorie.

Protocollo

1. Espressione e purificazione degli anticorpi

1. Manutenzione delle cellule CHO
   1. Coltivare le cellule CHO in terreni CHO FreeStyle integrati con 1x integratore di glutammina disponibile in commercio a 37 °C agitando a 130 giri/min con il 5% di CO₂ utilizzando fiasche di Erlenmeyer delong, in vetro o monouso.
      nota: Si consiglia vivamente di utilizzare un pallone deflettore con un tappo ventilato per aumentare l'agitazione e migliorare il trasferimento di gas durante le condizioni di agitazione. La resa anticorpale è stata significativamente ridotta con fiasche normali (non deflettore) a causa della limitata agitazione della coltura in sospensione.
   2. Mantenere il numero di cellule tra 1-5 x 10⁶ cellule/mL con una vitalità cellulare del >95%. Se il numero di cellule aumenta oltre 5 x 10⁶ cellule/mL, dividere le cellule. Non lasciare mai che le cellule CHO raggiungano meno di 0,2 x 10⁶ cellule/mL.
2. Trasfezione di cellule CHO
   1. Coltivare cellule CHO in 200 mL di terreno (2 x 10⁶ cellule/mL) in palloni deflettori Erlenmeyer delong.
      nota: Le colture in sospensione coltivate in fiasche defunte hanno sempre prodotto rese proteiche più elevate rispetto a quando coltivate in fiasche non deflettori.
   2. In una provetta da 15 mL, prelevare 5 mL di terreno CHO FreeStyle e aggiungere 50 μg di DNA clone VH e 75 μg di DNA clone VL. Vortice per mescolare bene.
   3. Incubare la miscela di DNA a temperatura ambiente per 5 min.
      nota: Un'incubazione più lunga riduce la resa proteica.
   4. Aggiungere 750 μL di 1 mg/mL di polietilenimmina (PEI) alla soluzione di DNA e agitare aggressivamente la miscela per 30 secondi. Incubare a temperatura ambiente per altri 5 min.
      nota: Il PEI deve essere prodotto fresco. Il ciclo di gelo e scongelamento multiplo del PEI riduce significativamente la resa complessiva.
   5. Aggiungere l'intera miscela di DNA e PEI alle cellule agitando manualmente il pallone. Incubare immediatamente i palloni deflettori di Erlenmeyer delong con celle a 37 °C che agitano a 130 giri/min.
3. Espressione
   NOTA: L'anticorpo ha un peptide segnale secretorio ingegnerizzato alla sua estremità N-terminale, che aiuta gli anticorpi a essere secreti nel terreno.
   1. Far crescere le cellule trasfettate a 37 °C, agitando a 130 giri/min il giorno 1.
   2. Il giorno 2, aggiungere 2 ml di agente antiaggregante 100x e 2 ml di soluzione antibatterico-antimicotica 100x. Spostare il pallone a una temperatura più bassa (32-34 °C), agitando a 130 giri/min.
   3. Ogni cinque giorni, aggiungere 10 ml di mangime Tryptone N1 e 2 ml di integratore di glutammina 100x.
   4. Continuare a contare le cellule ogni tre giorni utilizzando un emocitometro dopo aver colorato un'aliquota di cellule con una colorazione blu di tripano. Assicurarsi che la vitalità cellulare rimanga al di sopra dell'80%.
   5. Il giorno 10 o 11, raccogli il terreno per la purificazione degli anticorpi. Centrifugare la coltura a 3000 x g, 4 °C per 40-60 minuti e quindi filtrare il terreno trasparente utilizzando filtri per bottiglie da 0,22 μM.
4. Purificazione
   nota: La purificazione degli anticorpi viene eseguita utilizzando una colonna di proteina-A disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali), utilizzando una pompa peristaltica.
   1. Equilibrare la colonna con un volume di due colonne di tampone legante (20 mM di fosfato di sodio a pH 7,4).
   2. Far passare il terreno filtrato contenente l'anticorpo (ottenuto al punto 1.3.5) attraverso la colonna alla velocità di flusso di 1 mL/min.
   3. Lavare la colonna con un volume di due colonne di tampone di legatura.
   4. Eluire l'anticorpo in frazioni di 500 μl utilizzando 5 mL di tampone di eluizione (30 mM di acetato di sodio a pH 3,4).
   5. Neutralizzare il pH dell'anticorpo eluito aggiungendo 10 μl di tampone di neutralizzazione (3 M di acetato di sodio a pH 9) per frazione.
      nota: I numeri di frazione 3-6 contengono la maggior parte dell'anticorpo. Si consiglia di conservare tutte le frazioni nel caso in cui l'anticorpo venga eluito in una frazione successiva a quella prevista.
   6. Misurare la concentrazione di anticorpi purificati utilizzando uno spettrofotometro selezionando il protocollo predefinito per le IgG. La concentrazione finale dell'anticorpo si ottiene in mg/mL considerando il peso molecolare e il coefficiente di assorbimento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Supporti CHO FreeStyle	Tecnologie Gibco Life	Gatto # 12651-014
Anti-Anti (100X)	Tecnologie Gibco Life	Gatto # 15240-062
Agente antiaggregante	Tecnologie Gibco Life	Gatto # 01-0057DG
Siringa da insulina BD	BD Bioscienze	Gatto #329420
Calibro IVIS Spectrum	PerkinElmer	Gatto #124262
CHO CD EfficientFeed B	Tecnologie Gibco Life	Gatto #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	Gatto # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640	Corning	Gatto # 10-040-CV
Cy5 coniugato Anti-Human IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Gatto # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)	Tecnologie Gibco Life	Gatto # 35050-061
Kit HiPure Plasmid Maxiprep	Invitrogen	Gatto # K21007
Colonna HiTrap MabSelect SuRe	GE Sanità	Gatto # 11-0034-93
Isoflurano, USP	Covetrus	Gatto # 11695-6777-2
Unguento per gli occhi lubrificante	Aggiorna Lacri-Lube	Gatto #4089
Reagente di trasfezione PEI	Thermo Fisher	Gatto # BMS1003A
Modelli sperimentali: Linee cellulari
Umano: OVCAR-3	Collezione di cultura dei tipi americani	ATCC HTB-161
Umano: cellule CHO-K	Stalla trasformata nel nostro laboratorio	ATCC CCL-61
Mouse: 4T1	Gentile regalo del Dr. Chip Landen, UVA
Mouse: MC38	Gentile dono della Dott.ssa Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC	Autenticato tramite profilazione STR