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1. Espressione dell'emoagglutinina del virus dell'influenza tramite trasfezione
- Piastra le cellule del rene embrionale umano (HEK 293T) a una densità di 2 x 104 cellule/pozzetto in una piastra a 96 pozzetti trattata con coltura di tessuto bianco e lasciarla riposare per 4 ore in un incubatore a 37 °C (con il 5% di CO2).
- Trasfettare le cellule con 100 ng di DNA codificante per l'emoagglutinina virale e 0,2 μL di reagente di trasfezione per pozzetto in un volume totale di 50 μL.
nota: Sia il plasmide che il reagente transfettante sono diluiti in 1x Opti-Minimum Essential Media (MEM) Reduced Serum Medium.
- Dopo aver incubato le piastre in un incubatore a 37 °C con CO2 al 5% per 18 ore, rimuovere il terreno di trasfezione.
2. Valutazione dell'attivazione mediata da FcRg/NFAT dell'attività della luciferasi da parte di anticorpi monoclonali o sieri
- In primo luogo, sostituire i terreni di crescita delle cellule trasfettate con 25 μL di terreno di prova (1x RPMI 1640 integrato con sieri fetali bovini a basse IgG al 4% (vol/vol).
- In una piastra separata da 96 pozzetti, eseguire diluizioni quadruple degli anticorpi di interesse a partire da 30 μg/mL utilizzando il terreno di prova. Eseguendo le diluizioni in triplicati, un esempio di layout della piastra è illustrato nella Figura 1A. Assicurarsi che sia incluso un controllo che escluda gli anticorpi (nessun controllo anticorpale) e un controllo di fondo (solo tampone di saggio).
nota: Sia per il controllo "senza anticorpi" che per i controlli di fondo, aggiungere 25 μl di tampone di dosaggio al posto dell'anticorpo.
- Trasferire 25 μl di anticorpi diluiti in serie dalla fase 2.2 ai pozzetti corrispondenti sulla piastra delle cellule trasfettate.
- Incubare la piastra in un'incubatrice a 37 °C (con 5% di CO2) per 15 minuti.
- Aggiungere 25 μl dell'appropriato cellula effettrice modificata Jurkat che esprime FcgRIV murino o FcgRIIIa umano (75.000 cellule/pozzetto). Il volume totale per ciascun pozzetto deve essere di 75 μL e la concentrazione finale iniziale dell'anticorpo è di 10 μg/mL (Figura 1B).
nota: Per il controllo di fondo, aggiungere 25 μl di tampone del saggio al posto delle celle effettrici. Per esaminare la fagocitosi cellulo-mediata anticorpo-dipendente, è possibile utilizzare una cellula Jurkat modificata che esprime la FcgRIIa umana.
- Incubare la piastra in un'incubatrice a 37 °C con CO2 al 5% per 6 ore.
- Scongelare e scaldare il tampone del substrato di luciferasi in acqua a 37 °C per circa 1 ora prima dell'uso.
nota: Per realizzare il tampone del substrato della luciferasi, ricostituire il substrato del saggio della luciferasi liofilizzato nel tampone del saggio fornito. Il tampone di substrato ricostituito può essere conservato a una temperatura compresa tra -30 °C e -10 °C per un massimo di sei settimane.
- Aggiungere 75 μL/pozzetto di tampone substrato di luciferasi a tutti i pozzetti, ad eccezione del controllo di fondo.
- Leggi su un luminometro.
- Calcolare l'induzione del fold con la seguente equazione: Induzione del fold = (Valore indotto-Valore di fondo) / (Nessun valore mAb-Valore di fondo).
