Generazione di varianti di fuga dal virus dell'influenza contro gli anticorpi neutralizzanti

NOTA: Gli anticorpi specifici per l'HA che inibiscono la replicazione virale possono generalmente essere classificati in i) quelli che si legano sopra o adiacenti al sito di legame del recettore sulla parte superiore della testa globulare e ii) quelli che si legano distalmente del dominio di legame del recettore, che include il lato laterale della testa globulare e la regione del gambo dell'HA. Gli anticorpi che colpiscono il sito di legame del recettore impediscono l'impegno dei motivi dell'acido sialico sulla superficie delle cellule bersaglio e possono essere misurati utilizzando un test di inibizione dell'emoagglutinazione (HI). Gli anticorpi HI-negativi, come gli anticorpi specifici per il gambo, possono ancora inibire la replicazione virale, ma possono essere valutati solo utilizzando saggi di neutralizzazione.

1. Categorizzare gli anticorpi in base alle attività HI

1. Saggio HI
   1. In una piastra con fondo a V a 96 pozzetti, aggiungere 25 μl di PBS 1x sulle colonne da 2 a 12.
   2. Diluire l'anticorpo monoclonale (mAb) 7B2 (specifico per la testa), 6F12 (specifico per lo stelo) e un controllo isotipico a 100 μg/mL in 1x PBS e aliquotare 50 μL dei preparati anticorpali diluiti nella colonna 1. Inoltre, includere un controllo senza anticorpi monoclonali aggiungendo 50 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x (Figura 1A).
   3. Eseguire diluizioni seriali 2 volte degli anticorpi trasferendo 25 μl dalla colonna 1 alla colonna 2 e così via. Scartare gli ultimi 25 μl dalla colonna 12 (Figura 1A).
      nota: Assicurati di includere una riga di nessun controllo anticorpale.
   4. Diluire lo stock virale (un virus riassortante che esprime l'emoagglutinina (HA) e la neuraminidasi (NA) di A/California/04/09 con i segmenti interni di A/Puerto Rico/8/34) a 8 unità di emoagglutinazione/25 μL di stock virale diluito. Aggiungere 25 μl dello stock virale diluito (8 emoagglutinazione) a ciascun pozzetto (righe da A a G).
      nota: La miscela di anticorpi e virus deve avere un volume finale di 50 μL con una concentrazione finale iniziale di 50 μg/mL.
   5. Incubare la piastra a temperatura ambiente (RT) per 45 minuti.
   6. Per la riga di titolazione inversa (H), aggiungere 50 μl di PBS 1x sui pozzetti da H2 a H12. Aggiungere 100 μl delle 8 unità di emoagglutinazione/25 μl al pozzetto H1. Diluire in serie due volte trasferendo 50 μl da H1 a H2 e così via. Scartare gli ultimi 50 μl dal pozzetto H12. Infine, aggiungere 50 μl di globuli rossi di pollo allo 0,5% a tutti i pozzetti della piastra con fondo a V a 96 pozzetti.
      nota: I campioni di mAb nel test devono avere un volume finale di 100 μL: mAb (25 μL), virus (25 μL) e globuli rossi (50 μL). Il volume finale del controllo senza anticorpi monoclonali deve contenere 25 μl di 1x PBS, 25 μl di virus e 50 μl di globuli rossi.
   7. Incubare la piastra a 4 °C per 1 ora.
   8. Leggere visivamente le piastre per l'attività HI. Se c'è una lettura positiva per un particolare anticorpo, procedere al passaggio 2.1 per generare varianti di fuga. Se l'anticorpo è HI-negativo, procedere al punto 1.2 per valutare se l'anticorpo ha attività neutralizzante in un test di coltura cellulare.
      nota: Una lettura positiva di un anticorpo monoclonale HI-attivo è indicata da un pellet di globuli rossi rosso scuro al centro di un pozzetto (Figura 1B; 7B2) che formerà una lacrima quando la piastra del fondo a V a 96 pozzetti viene tenuta a un angolo di 45°. Una lettura negativa non formerà un pellet di globuli rossi rosso scuro nel pozzetto (Figura 1B; 6F12 e nessun mAb). Inoltre, il controllo dell'isotipo non formerà un pellet di globuli rossi rosso scuro e dovrebbe apparire identico all'anticorpo specifico per il gambo, 6F12 o al campione di controllo senza anticorpi monoclonali (Figura 1B).

2. Generazione di varianti mutanti di Escape

NOTA: Gli anticorpi neutralizzanti che hanno o mancano di attività HI vengono ulteriormente analizzati con i protocolli specifici descritti di seguito.

1. Protocollo 1: Anticorpi HI-positivi/Neutralizzazione-positivi (Figura 2A)
   1. Preparare uno stock virale di 10-6 unità formanti placche/millilitro (PFU/mL) in 1x PBS in un volume di 400 μL.
   2. Preparare quattro diluizioni dell'anticorpo di interesse in concentrazioni crescenti (ad es. 0, 0,5, 0,05 e 0,005 mg/mL) in 1x PBS in un volume di 100 μL per diluizione.
      NOTA: Il virus wild-type deve essere sempre fatto passare in parallelo e in assenza di anticorpi. Le sequenze di questi virus passati aiuteranno a distinguere tra l'adattamento alle condizioni di coltura cellulare e le mutazioni di fuga.
   3. Miscelare 100 μL di^10-6 PFU/mL di virus con 100 μL di ciascuna diluizione di anticorpi o 100 μL di 1x PBS.
   4. Incubare per 1 ora in un incubatore a 37 °C (con CO₂ al 5%). Vortice brevemente. Iniettare 200 μl di ciascuna miscela in uova di gallina embrionate prive di patogeni specifici (SPF).
   5. Incubare le uova a 37 °C (senza CO₂) per 40-44 h.
   6. Sacrificare le uova infette-embrionate dal virus incubandole a 4 °C per un minimo di 6 ore.
   7. Raccogliere il liquido allantoideo dalle uova, come descritto in precedenza.
   8. Eseguire il test di emoagglutinazione, come descritto sopra. Se tutte le preparazioni di liquido allantoico non hanno titoli di emoagglutinazione, ripetere dal passaggio 2 con diluizioni anticorpali comprese tra 0,005 mg/mL e 0,00005 mg/mL.
      nota: Una concentrazione saturante di un anticorpo HI-positivo può neutralizzare tutte le particelle virali presenti. Pertanto, potrebbe essere necessario diminuire la quantità di anticorpi presenti nel passaggio.
   9. Confermare le varianti di fuga eseguendo il test HI (passaggio 1.1).
      nota: Gli anticorpi HI-attivi bloccano l'impegno dell'acido sialico sulle cellule bersaglio. Pertanto, un virus in presenza del suo anticorpo affine perde la capacità di agglutinare i globuli rossi (presenza di pellet di globuli rossi). In teoria, le varianti di fuga degli anticorpi HI-attivi possono ancora legare i motivi dell'acido sialico anche in presenza del suo anticorpo affine e quindi possono agglutinare i globuli rossi (senza pellet di globuli rossi). Se l'HI dell'anticorpo di interesse è ancora rilevabile, ripetere il protocollo dal passaggio 2.1.2 con una concentrazione iniziale più alta dell'anticorpo.

Figura 1: Saggio HI. (A) Uno schema per l'impostazione di un test HI per testare l'attività di due mAb di topo H1-specifici 7B2 (specifico per la testa) e 6F12 (specifico per il gambo) utilizzando una piastra V-bottom a 96 pozzetti, e (B) un esempio dei risultati di un test HI

Figura 2: Generazione di mutanti di fuga. La metodologia suggerita dipenderà dall'HI e dall'attività di microneutralizzazione esibita dall'anticorpo. La generazione di mutanti di fuga contro (A) anticorpi HI-positivi neutralizzanti può richiedere un singolo passaggio nelle uova, mentre (B) gli anticorpi HI-negativi neutralizzanti possono comportare passaggi multipli con quantità crescenti di anticorpi in coltura di tessuto cellulare.