Generazione di anticorpi monoclonali ricombinanti da colture cellulari di mammifero

Abstract

Fonte: Nogales-Gadea, G. et al., Generazione di anticorpi monoclonali IgG umani ricombinanti da cellule B selezionate immortalizzate.J. Vis. Exp.(2015)

Questo video dimostra un metodo di generazione di anticorpi da cellule di mammifero introducendo vettori plasmidici con geni a catena pesante e leggera. Questi vettori interagiscono con la polietilenimmina ed entrano nelle cellule formando poliplessi; Successivamente, vengono tradotte in singole proteine e assemblate in anticorpi completi, che vengono secreti nel mezzo extracellulare.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)

1. Centrifugare 25 ml di sangue eparinizzato dei partecipanti a 900 x g per 15 minuti, il prima possibile dopo l'estrazione del sangue. Se c'è meno sangue, ridurre i reagenti di conseguenza. Esegui tutti i passaggi successivi in una cappa.
2. Trasferire il siero in un tubo pulito. Può essere utilizzato in fasi successive per il congelamento di PBMC o, in caso di pazienti autoimmuni, per testare gli autoanticorpi.
3. Diluire il sangue con 10 ml di terreno 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e risospendere le cellule pipettando su e giù.
4. Aggiungere 15 ml di una soluzione contenente polisaccarosio e diatrizoato di sodio (1,077 g/ml) in un nuovo tubo da 50 ml.
5. Stratificare delicatamente il sangue sopra la soluzione al punto 1.4 avvicinando le due aperture delle provette fino a quando i due liquidi entrano molto lentamente in contatto, quindi decantare lentamente la sospensione di PBMC sopra la provetta da 50 ml. Questo passaggio è fondamentale per avere una buona separazione delle PBMC.
6. Centrifugare la provetta ottenuta al punto 1.5 a 400 x g senza freno a temperatura ambiente (RT) per 20 min.
7. Dopo la centrifugazione, recuperare con la pipetta l'anello bianco che appare nella parte centrale della provetta, che contiene le PBMC.
8. Lavare le celle con 25 ml di terreno RPMI 1640.
9. Centrifugare 300 x g a RT per 10 min.
10. Scartare il surnatante e lavare le cellule con 10 ml di RPMI 1640. Centrifugare nuovamente come al punto 1.9.
11. Conta le PBMC con una camera Neubauer come riportato in precedenza.
12. Processare le PBMC come indicato nella sezione 2 o conservarle per un uso successivo come segue: 10 milioni di PBMC per congelamento per provetta criovale diluita in 1 ml di dimetilsolfossido al 10% (DMSO) e siero al 90% ottenuto nella fase 1.2. Congelare progressivamente e per una lunga conservazione in azoto liquido.

2. Colorazione delle PBMC per la selezione di CD22+ e immunoglobuline G (IgG+) mediante citometria cellulare

1. Placcare le PBMC in un pallone di coltura cellulare da 25 cm² con 6 ml di terreno RPMI 1640 completo (integrato con L-glutammina, 10 mM di tampone 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanesolfonico (HEPES), 50 U/ml di penicillina, 50 μg/ml di streptomicina e 10% di siero fetale bovino) e lasciarle recuperare O/N nell'incubatore a 37 °C al 5% di anidride carbonica (CO₂).
2. Bloccare le provette sterili per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) con una soluzione salina tamponata con albumina fosfato (PBS) sterile al 4% durante la notte (O/N). Lavare le provette due volte con PBS e riempirle con 500 μl di terreno RPMI 1640 completo. Utilizzare queste provette per recuperare le cellule dopo la cernita.
3. Raccogliere i PBMC in una provetta e centrifugare a 400 x g a RT per 5 minuti.
4. Risospendere le celle nel buffer di etichettatura (vedere i passaggi 2.5 e 2.6) e contarle. Il tampone di marcatura è costituito da siero fetale bovino sterile al 2% e acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) da 1 mM in PBS.
5. Preparare 3 provette FACS con 10-5 celle ciascuna e risospenderle in 100 μl di tampone di marcatura. Questi tubi serviranno per definire le porte di selezione.
   1. Nella prima provetta aggiungere 5 μl di anticorpo anti-CD22 PerCP (raccomandato nella scheda tecnica del produttore), nella seconda provetta 20 μl di anti IgG PE (raccomandato nella scheda tecnica del produttore) e nulla nella terza provetta. Incubare in ghiaccio e al buio per 30 minuti.
6. Risospendere 5 milioni di cellule in 200 μl di tampone di marcatura in una provetta FACS e aggiungere 10 μl di AntiCD22 PerCP e 40 μl di Anti-IgG PE. Incubare le cellule in ghiaccio e al buio per 30 minuti. Se si desidera selezionare un numero maggiore di cellule, aumentare le dimensioni di tutti i reagenti.
7. Centrifugare le celle a 400 x g con un freno basso per 5 minuti a RT.
8. Decantare delicatamente il surnatante.
9. Risospendere le cellule in 500 μl di tampone di marcatura. Centrifugare le celle a 400 x g con un freno basso per 5 minuti a RT. Ripetere i passaggi 2.7 e 2.8
10. Decantare delicatamente il surnatante e risospendere le cellule in 300 μl di terreno completo RPMI.
11. Far passare le celle attraverso un filtro da 0,45 μm. Le celle sono pronte per l'ordinamento.

3. Selezione delle cellule B CD22+ e IgG+

1. Utilizzare 3 provette di controllo per stabilire la vitalità delle cellule. Nel controllo senza colorazione, utilizzare il grafico a dispersione in avanti e le dimensioni per definire il gating dei linfociti. I controlli con il CD22 PerCP e l'anti-IgG PE servono a stabilire i cancelli e il cancello di smistamento. Eseguire seguendo i dati riportati in precedenza.
   NOTA: Un gate è un insieme di limiti di valore (confini) che servono a isolare un gruppo specifico di eventi citometrici, nel nostro caso le cellule, da un insieme ampio. Nel caso di una porta di smistamento il valore limite consente il recupero degli eventi citometrici, cellule, che si trovano all'interno dei confini definiti: CD22+ e IgG+.
2. Come provetta di raccolta nella cernita, utilizzare le provette bloccate con 500 μl di terreno RPMI 1640 completo, ottenuto dal passaggio 2.2.
3. Procedere con l'ordinamento dei doppi positivi: CD22+ IgG+. NOTA: il numero finale di celle in ogni condizione. Piastre ordinate le celle sopra le celle di alimentazione il prima possibile.

4. Irradiazione delle celle di alimentazione

NOTA: Esegui la preparazione delle celle di alimentazione tra 1 e 3 giorni prima della cernita. Sono necessarie almeno 5.000 celle wi38 per pozzetto in una piastra rotonda da 96 pozzetti. Eseguire i passaggi 4.1, 4.2 e 4.4 in una cappa.

1. Coltivare le cellule wi38 a 37 °C e 5% di CO₂ in terreno RPMI 1640 completo (lo stesso delle PBMC) fino a raggiungere il numero di cellule desiderato.
2. Irradiali a 50 Grigi, seguendo un protocollo descritto in precedenza. Eseguire l'irradiazione una volta che le cellule wi38 sono state tripsinizzate e risospese in un mezzo RPMI completo, o con wi38 attaccato al pallone di coltura e tripsinizzato dopo l'irradiazione. Seguire il metodo per la tripsinizzazione indicato dal fornitore delle celle wi38. Irradiare il numero di cellule necessario per coprire i pozzetti necessari per la placcatura delle cellule B IgG+ (1% del totale delle PBMC contate al punto 1.11).
3. Piastra da 90 μl contenente 5.000 cellule wi38 irradiate in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti rotondi. Lasciare vuoti i pozzetti nella fila esterna della piastra (perché evaporano più velocemente) e utilizzare solo i 60 pozzetti al centro della piastra per le celle di placcatura. Riempire i pozzetti esterni che incorniciano la piastra con 200 μl di PBS.
4. Metterli in un'incubatrice a 37 °C al 5% di CO₂, fino al momento del bisogno.

5. Placcatura di PBMC ordinati, infezione da virus di Epstein-Barr (EBV) e crescita

1. Diluire le PBMC selezionate, per placcare 50 celle in 50 μl di terreno completo RPMI 1640 per pozzetto nella piastra a 96 pozzetti rotondi (precedentemente placcata con celle irradiate wi38). Eseguire i passaggi in una cappa attrezzata per il lavoro EBV.
   NOTA: l'infezione di 50 cellule per pozzetto è ottimizzata e aumenta la probabilità di produrre un anticorpo monoclonale, tuttavia, si consiglia di verificarlo mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) come descritto in precedenza.
2. Aggiungere 60 μl di surnatante EBV (contenente 3 - 4 x 10⁸ copie virali/ml) a ciascun pozzetto nella piastra a 96 pozzetti rotondi. CAUTELA deve essere presa durante il lavoro con EBV.
3. Aggiungere 1 μg/ml di CpG (ODN2006) per pozzetto.
4. Lasciare le cellule in un incubatore a 37 °C al 5% di CO₂.
5. Monitora visivamente la crescita dei cloni al microscopio dopo una settimana.
   NOTA: Alcuni esempi di crescita delle cellule B possono essere visti di seguito nella sezione dei risultati. Si noti che i tassi di crescita dei cloni possono variare e potrebbe essere necessario più tempo per iniziare a vedere un po' di massa cellulare crescere al centro del pozzetto.
6. Dopo le prime due settimane, monitorare la crescita del clone al microscopio ottico e procedere al primo scambio di terreno. Pipettare lentamente 90 μl di terreno dalla parte superiore del pozzetto e raccoglierlo in una piastra pulita a 96 pozzetti. (Le cellule B si trovano sul fondo del pozzetto, quindi non c'è rischio di aspirarle).
   1. Aggiungere a ciascun pozzetto 100 μl di terreno RPMI 1640 completo integrato con 1 μg/ml di CpG (ODN2006) e 50 U/ml di IL2. Se i cloni sono in crescita, analizzare questo primo scambio di terreni mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) come nella fase 6.
7. Monitorare la crescita dei cloni e cambiare i terreni dopo la 3a e la 4a settimana di ricrescita prelevando 90 μl di terreno e aggiungendo 100 μl di terreno RPMI 1640 completo integrato con 1 μg/ml di CpG (ODN2006) e 50 U/ml di IL2. Utilizzare il surnatante raccolto per monitorare la produzione di IgG mediante ELISA come al punto 6.
   NOTA: Dopo un mese la crescita dei cloni dovrebbe essere evidente osservando aggregati di cellule rotonde che di solito si trovano al centro del pozzetto del fondo rotondo.
8. A questo punto, cambiare i supporti nello stesso modo delle settimane precedenti, ma solo con i supporti RPMI 1640 completi. Un buon indicatore per sapere qual è il momento giusto per cambiare media è il colore del media, se sta diventando giallastro le celle hanno bisogno di uno scambio di media.
9. Quando le piastre da 96 pozzetti contengono cloni di grandi dimensioni (circa 5 x 10⁵ cellule), trasferirli in un pozzetto piatto di una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere 300 μl di terreno RPMI 1640 completo al nuovo pozzetto. Risospendere il clone in crescita a 96 pozzetti, pipettandolo su e giù più volte, e trasferire le cellule nel nuovo pozzetto, distribuendole in modo omogeneo. Aggiungi nuovi file multimediali quando necessario.
   1. Quando i pozzetti della piastra a 24 pozzetti sono pieni di celle (circa 5 x 10⁶ celle), trasferire in un pozzetto piatto di una piastra a 6 pozzetti. Aggiungere 2 ml di terreno RPMI 1640 completo al nuovo pozzetto. Risospendere le cellule nella piastra a 24 pozzetti pipettando più volte su e giù e distribuirle in modo omogeneo nel nuovo pozzetto.
10. Aggiungi i file multimediali quando necessario. Se le cellule non devono essere mantenute in coltura, pellettare le cellule a 400 x g per 5 minuti a RT. Conservare i surnatanti per il test ELISA. Lavare il pellet di cellule una volta con 1 x PBS, centrifugare nuovamente a 400 x g per 5 minuti e conservare in asciutto a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA.
    1. Quando le cellule nella piastra a 6 pozzetti diventano confluenti (circa 20 x 10⁶ cellule), trasferirle in una piastra di coltura da 60 mm. Aggiungere 4 ml di supporto RPMI 1640 completo alla nuova piastra. Risospendere le cellule in una piastra a 6 pozzetti e trasferirle come fatto nei passaggi 5.9 e 5.10.
11. Aggiungi nuovi file multimediali quando necessario. A questo punto, congelare le cellule a 10-30 milioni/ml in 90% siero fetale di vitello e 10% DMSO. Se si desidera una maggiore quantità di cellule, continuare l'espansione dei cloni in piastre di superficie più grandi.

6. ELISA per il rilevamento di anticorpi IgG

1. Erogare 50 μl/pozzetto in una piastra ELISA di anticorpo Fc F(ab)₂ di capra diluito 1 200 in tampone di rivestimento. Il tampone di rivestimento contiene 50 mM di carbonato di sodio (Na₂CO₃), pH 9,6.
2. Sigillare le piastre con un adesivo di plastica e incubare 1 ora a 37 °C. In alternativa, incubare a 4 °C O/N.
3. Lavare ogni pozzetto 6 volte con 200 μl di tampone di lavaggio. Il tampone di lavaggio contiene lo 0,05% di Tween-20 in 1 x PBS. Non toccare o graffiare la superficie del pozzetto in cui l'anticorpo si è legato.
4. Blocco con tampone di blocco, 100 μl/pozzetto. Il tampone bloccante contiene il 4% di latte scremato in polvere in PBS. Sigillare la piastra e incubare 1 ora a 37 °C.
5. Non lavare. Eliminare il tampone bloccante e schiaffeggiare la piastra 3 volte capovolta su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido residuo.
6. Incubare i surnatanti e gli standard dei cloni.
   1. Per un primo test, diluire i surnatanti cloni ottenuti al punto 5.6 o 5.7 1/3 in RPMI. Per gli standard, diluire con la soluzione di IgG umane medie RPMI per ottenere: 1.000 ng/ml, 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml, 62,5 ng/ml, 31,25 ng/ml, 15,6 ng/ml e bianco. Utilizzare 50 μl/pozzetto e incubare a 37 °C per 60 minuti. Analizzare ulteriori diluizioni del surnatante del clone per testare l'affinità anticorpale, come 1/10 o 1/100.
7. Lavare come fatto al punto 6.3.
8. Utilizzare 50 μl/pozzetto di capra F (ab)2 anti-IgG Fc perossidasi coniugata diluita 1:20.000 nel tampone di incubazione. Il tampone di incubazione contiene l'1% di albumina sierica bovina (BSA) e lo 0,02% di Tween 20 in 1x PBS. Incubare a 37 °C per 60 min.
9. Lavare come fatto al punto 6.3.
10. Aggiungere 100 μl/pozzetto di soluzione di substrato contenente lo 0,1% di 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). Incubare per 10 minuti fino a quando non si forma un colore blu stabile nei pozzetti. Stai attento; Non aspettare troppo a lungo!
11. Arrestare la reazione aggiungendo 50 μl di acido solforico 2 M (H₂SO₄). Misurare l'assorbimento a 450 nm, entro 30 minuti dall'arresto della reazione.
    NOTA: Tutti i surnatanti dei cloni con 3 deviazioni standard rispetto al bianco saranno considerati positivi per gli anticorpi umani IgG. Per confermare i cloni positivi, questo ELISA deve essere ripetuto almeno tre volte in diversi surnatanti dello stesso clone. Inoltre, si raccomanda di scartare la possibilità di una reattività crociata aspecifica per assicurarsi che non vi sia segnale quando i surnatanti vengono incubati in pozzetti non rivestiti ma ostruiti. In questa fase, è possibile eseguire un test di rilevamento per lo screening della specificità antigenica degli anticorpi di interesse prima di procedere al paragrafo 7.

7. Isolamento dell'RNA e sintesi del DNA complementare (cDNA) del primo filamento dei cloni IgG produttori

1. Non appena la produzione di IgG è confermata dall'ELISA, estrarre l'RNA del clone.
2. Per estrarre l'RNA dalle cellule che crescono nei passaggi 5.7 o 5.9, utilizzare il kit di sintesi diretta del cDNA delle cellule in apice III, che consente di ottenere il DNA da 10.000 cellule a una cellula.
3. Per estrarre l'RNA da grandi quantità di cellule o dal pellet immagazzinato nel passaggio 5.11, utilizzare il kit di isolamento dell'RNA ad alta purezza. In questa fase possono essere adatti anche altri sistemi di estrazione dell'RNA. Seguire le istruzioni del produttore.
4. Per numeri di cella compresi tra 1 x 10⁶ e 1 x 10⁴ utilizzare il sistema di trascrizione inversa, seguendo le istruzioni del produttore. Possono essere utilizzati anche altri sistemi per la sintesi del cDNA del primo filamento.

8. 1° e 2° PCR per l'amplificazione delle catene pesanti e leggere dei cloni di cellule B produttrici di IgG

1. Con il cDNA dei cloni cellulari, ottenuto nello step 5.6 e 5.7 e positivo nell'ELISA IgG nello step 6, eseguire la PCR con i primer elencati in Tabella 1.
2. Impostare PCR indipendenti per ogni catena IgG pesante, kappa e lambda. Preparare una soluzione madre con primer in avanti e indietro in concentrazioni uguali. Aggiungerli alla reazione alla concentrazione finale di 0,4 μM.
3. Utilizzare 1 μl di sintesi del cDNA per eseguire la 1^ST PCR. Qui, eseguire reazioni da 20 μl utilizzando le istruzioni del produttore di Takara Taq. In alternativa, utilizzare altre polimerasi.
4. Posizionare la^1st PCR nelle seguenti condizioni di ciclo: 94 °C per 5 min; (50 cicli di: 94 °C per 30 sec; 58 °C per 30 sec e 72 °C per 45 sec; 72 °C per 7 min; lasciarlo raffreddare a 4 °C.Includere un bianco nella reazione, per rilevare eventuali contaminazioni.
5. Preparare 1x TBE (89 mM di tris-borato e 2 mM di EDTA). In un volume di 100 ml di 1x TBE aggiungere 1 g di agarosio (gel di agarosio all'1%). Scaldare la soluzione nel microonde per circa 1 minuto, fino a quando l'agarosio non si sarà sciolto. Quindi aggiungere 4 μl di 10 mg/ml di bromuro di etidio (o colorante di DNA equivalente) e mescolare.
   1. Versare il contenuto in una teglia e attendere che venga polimerizzato. Eseguire 5 μl della miscela PCR nel gel per visualizzare le bande. I frammenti di catena pesanti dovrebbero essere di circa 400 - 550 bp, mentre la catena leggera dovrebbe essere di circa 300 - 400 bp. Se le bande non vengono rilevate, procedere allo stesso modo alla^2nd PCR.
6. Utilizzare 1 μl della prima miscela PCR per eseguire la^2a PCR. Utilizzare gli stessi reagenti del passaggio 8.2 ma utilizzando la miscela di primer adatta (vedere Tabella 1). Per la 2a^PCR utilizzare le seguenti condizioni: 94 °C per 5 min; (50 cicli di: 94 °C per 30 sec; 56,5 °C per 30 sec e 72 °C per 55 sec); 72 °C per 7 min; lasciarlo raffreddare a 4 °C. Includere un bianco nella reazione, per rilevare eventuali contaminazioni da PCR.
7. Preparare un gel di agarosio come descritto al punto 8.5. Eseguire il gel per visualizzare il prodotto PCR come in 8.5.1 Utilizzare le amplificazioni che contengono i frammenti della giusta dimensione per la clonazione nella fase 9 e produrre gli anticorpi nella fase 10.
8. Sequenziare il DNA, utilizzando una reazione da 10 μl contenente: 100 ng della 2a PCR, 0,2 μM del primer o della miscela di primer, 1 μl del terminatore e 1 μl del tampone. Eseguire la reazione di sequenziamento nelle seguenti condizioni: (25 cicli di: 96 °C per 10 sec; 50 °C per 5 sec; e a 60 °C per 4 min); 60 °C per 7 min; lasciarlo raffreddare a 4 °C.
9. Purificare le reazioni di sequenziamento con le colonne microspin G50 seguendo le istruzioni del produttore. Valutare le sequenze della legatura in un analizzatore automatico di sequenze come descritto in precedenza. Gli elettroferogrammi devono essere puliti e corrispondere a una singola sequenza di immunoglobuline.
   NOTA: Se i prodotti PCR mostrano sequenze di immunoglobuline non chiare o miste, si prega di considerare di clonarli utilizzando il sistema TopoTA, per ottenere sequenze isolate e quindi procedere al passaggio 9.

9. Clonazione e sequenziamento delle catene pesanti e leggere dei cloni IgG produttori

1. Preparare 1 μg di DNA dei vettori pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss-CLIg-hl2 e pFUSEss-CHIg-hG1.
2. Digerire questi vettori con gli enzimi di restrizione appropriati. Utilizzare EcoRI e BsiWI per pFUSE2ss-CLIg-hk, EcoRI e AvrII per pFUSE2ss-CLIg-hl2 ed EcoRI e NheI per pFUSEss-CHIg-hG1. Utilizzare 3 unità di ciascun enzima di restrizione per 1 μg di DNA del vettore.
   1. Digerire con un enzima e purificare il prodotto digerito con un kit di purificazione PCR. Digerire con il secondo enzima e purificare con un kit di estrazione in gel (secondo il protocollo del produttore). Tagliare il frammento di interesse dal gel di agarosio. Preparare il gel di agarosio come al punto 8.5.
3. Digerire i 2^prodotti della PCR del clone IgG produttore: EcoRI e BsiWI per l'amplificazione della catena kappa, EcoRI e AvrII per l'amplificazione della catena lambda ed EcoRI e Nhe I per l'amplificazionedella catena pesante. Digerire con un enzima e purificare il prodotto digerito con un kit di purificazione PCR. Digerire con il secondo enzima e purificare il prodotto digerito con un kit di purificazione PCR. Utilizzare le stesse unità di misura degli enzimi e la stessa quantità di DNA del punto 9.2.
4. Legare i frammenti di PCR all'interno dei vettori con DNA ligasi T4 16 °C O/N seguendo le raccomandazioni del produttore. Il rapporto utilizzato dovrebbe essere 1 : 2 (vettore : inserisci).
5. Utilizzare 1 μl di legatura per trasformare i batteri DH5α. Seguire le condizioni del produttore DH5α per la trasformazione. Diffondere i batteri in piastre di blasticidina o zeocina, a seconda del tipo di vettore utilizzato. Incubare le piastre O/N a 37 °C.
6. Coltiva singole colonie ed estrai il DNA con un kit miniprep, seguendo le istruzioni del produttore. Utilizzare per la crescita di singole colonie e l'estrazione del DNA secondo le raccomandazioni del produttore dal kit di miniprep del DNA. Analizzarli per digestione con gli enzimi utilizzati per la preparazione di vettori e inserti come nei passaggi 9.2 e 9.3.
7. Sequenziare il DNA, utilizzando 100 ng del vettore come fatto nei passaggi 8.8 e 8.9.

10. Produzione di anticorpi nelle cellule HEK

1. Coltiva le cellule HEK nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale di vitello, l'1% di L-glucosio, l'1% di penicillina/streptavidina (DMEM+) fino a una confluenza del 75% in una piastra di coltura cellulare da 150 mm. Eseguire in una cappa i passaggi da 10.1 a 10.7.
2. Prima della trasfezione, scambiare il medio con il medio come prima ma senza siero fetale di vitello.
3. Per ogni trasfezione di catene leggere pesanti, preparare una miscela di trasfezione con 2,5 ml di DMEM (senza siero), 9 μg del vettore con la catena pesante, 6 μg del vettore con la catena leggera e 100 μl di soluzione di polietilenimmina (PEI) (da un impasto da 1 μg/μl). Incubare a RT per 15 min.
4. Aggiungere delicatamente 2,5 ml della miscela di trasfezione preparata al punto 10.3 alle cellule HEK nella piastra. Scuotere il piatto per distribuirlo in modo omogeneo.
5. Incubare le cellule nell'incubatore a 37 °C con CO₂ al 5% per 24 ore.
6. Cambiare il terreno di coltura con un medio senza siero fetale di vitello.
7. Raccogli il terreno dalle piastre 4 giorni dopo.
   NOTA: Gli anticorpi nei terreni possono essere utilizzati per caratterizzare la loro reattività in vitro e in vivo.

Tabella 1. Inneschi utilizzati.

1primer per PCR
	Avanti (5'-3')	Rova (3'-5')
IgG	5′ L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG	3′ Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC
	5′ L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGTGCAG
	5′ L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
	5′ L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
κ	5′ L Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG	3′ Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCCTCA
	5′ L Vκ 3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG	3′ Cκ 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCTCTCTCT
	5′ L Vκ 4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG
	5′ Pan Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
λ	5′ L Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG	3′ Cλ CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG
	5′ L Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
	5′ L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
	5′ L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
	5′ L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
	5′ L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
	5′ L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG
2primer per PCR
	Avanti (5'-3')	Rova (3'-5')
IgH	5′ EcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG TGCAG	3′ NheI JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT GACCAG
	5′ EcoRI VH1 a 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGCAG	3′ NheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA CCATTG
	5′ EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGGAG	3′ NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG ACCGTG
	5′ EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT GTTGGAG
	5′ EcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC AGCAGTG
	5′ EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT GGTGCAG
	5′ EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT GGTACAG
	5′ EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT GCAGCAG
κ	5′ EcoRI Vκ 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA CCCAGTC	3′ BsiWI Jκ da 1 a 4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC CCAGTCT	3′ BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACGTTTGATCTCCAG CTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA CCCAGTC	3′ BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT TTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA CCCAGAC
	5′ EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA CTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAGAAATTGTGTTG ACACAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAGAAATAGTGATG ACGCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT
	5′ EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG ACCCAGTC
λ	5′ EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCAGTCTGTGCT GACKCAG	3′ AvrII Jλ 1 a 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT TGGTCCC
	5′ EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCAGTCTGCCC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC TGGGTTCC
	5′ EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG	3′ AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC TCGGTCCC
	5′ EcoR1 Vλ da 4 a 5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG CTGACTCA	3′ AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT GGGTGCC
	5′ EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGAGGACGGTCAC TTGGTCCAT
	5′ EcoR1 Vλ 7 a 8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG GTGACYCAG

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	Codice 10771	soluzione contenente polisaccarosio e diatrizoato di sodio
Selezionatore cellulare FACSAria II	BD Bioscienze
96 piastre per micropozzetti con fondo a U	Costar	Telefono 3799
Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio	Gibco, Tecnologie per la vita	Codice 12633-020
30% v/v surnatante contenente EBV della linea cellulare B95-8	ATCC	Codice CRL-1612	3,4 x 108 copie/ml
CpG2006	Invivogen	ODN 7909
Celle Wi38	Sigma-Aldrich	90020107
Interleuchina-2	Roche	10799068001
Piastre ELISA	Greiner Bio-One, Microlon	655092
AffiniPure F(ab')2 Frammento di capra Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (non coniugato)	Jackson ImmunoResearch	Codice 109-006-008
4% latte scremato in polvere (Blotting Grade Blocker)	Biorad	Codice 170-6404
IgG umane	sigma	I 2511	Immunoglobulina purificata con IgG UMANE, 5,6 mg/ml
IgG Fcγ antiumane F(ab)2 di capra (coniugata con perossidasi (PO))	Jackson ImmunoResearch	Codice 109-036-008
Lettore ELISA (Perkin Elmer 2030)	Perkin Elmer	Codice 2030-0050
AffiniPuro IgM anti-umano di coniglio coniugato con perossidasi, Fc5μ	Jackson ImmunoResearch	Codice 309-035-095
Sistema di sintesi diretta del cDNA delle cellule SuperScript III	Invitrogen	18080-200
Sistema di PCR GeneAm 2700 di Applied Biosystems (ABI)	Biosistemi Applicati
Kit di isolamento dell'RNA ad alta purezza	Roche	11828665001
Kit per il sistema di trascrizione inversa	Promega	A3500
Taq DNA polimerasi ricombinante	Takara	R001A
Primer (2μl)	sigma
Agarosio ultrapuro	Invitrogen	16500-500
Scala da 100 bp	Invitrogen	Codice 15628-019
Quantità Uno 4.5.2 (Gel Doc 2000)	Biorad	170-8100
Kit di purificazione per PCR QIAquick	QIAGEN	Codice 28106
Kit di sequenziamento del ciclo BigDye Terminator v3.1	Biosistemi Applicati	4337455
Piastra di reazione da 0,1 ml (MicroAMP Optical 96-well)	Biosistemi Applicati	4346906
Analizzatore genetico ABI300	Biosistemi Applicati	4346906
Cellule competenti DH5α (E. coli)	Invitrogen	Codice 18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp)	Invivogen	pfuss-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp)	Invivogen	pfuss-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp)	Invivogen	pfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp)	Invivogen	pfuse2ss-hcll2
Mezzo SOC	Invitrogen	Codice 15544-034
Terreno di coltura agar a base di LB integrato con Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)	Invivogen	fas-zn-s
Terreno liquido a base di Terrific Broth (TB) integrato con Zeocin (Fast-Media Zeo TB)	Invivogen	fas-zn-l
Kit di miniprep DNA	Tecnologia Omega Bio	D6942-02
Nanodrop (spettrofotometro ND1000)	Nanogoccia
Terreno di coltura agar a base di LB integrato con blasticidina (Fast-Media Blast Agar)	Invivogen	fas-bl-s
Terreno liquido a base di Terrific Broth (TB) integrato con Blasticidina (Fast-Media Blast TB)	Invivogen	fas-bl-l
EcoRI	Biolaboratori del New England	R0101S	20.000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI
NheI	Biolaboratori del New England	R0131S	10.000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1
Scala DNA a 2 tronchi	Biolaboratori del New England	N3200S	0,1-10,0 kb, 1.000 μg/ml
Natale	Biolaboratori del New England	R0180S	10.000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer
BsiWI	Biolaboratori del New England	R0553S	10.000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1
AvrII	Biolaboratori del New England	R0174S	5.000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer
FastAP Fosfatasi alcalina termosensibile	Termo Scientifico	EF0651	1 U/μL, in tampone FastAP 10x
Cellule competenti DH5α	Invitrogen	Codice 18263-012
PE Topo Anti-IgG Umano	BD Pharmingen	555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22	Fisher scientifico	BDB563942
Kit Miniprep SPIN QIAprep	QIAGEN	Codice 27106
Terminator BigDye v3.1	Biosistemi Applicati	4337455