Tutte le procedure del modello animale sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Immunizzazione animale
- Per via sottocutanea (s.c.) iniettare topi femmina BALB/c, di 6-8 settimane di età, con 50 μg di proteina APN o soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, controllo negativo) miscelati con adiuvanti una volta ogni 2 settimane. Utilizzare l'adiuvante di Freund completo che contiene i micobatteri uccisi dal calore per l'immunizzazione iniziale e l'adiuvante di Freund incompleto per le immunizzazioni di richiamo. Mescolare volumi uguali di proteina APN (o PBS) e adiuvante di Freund o adiuvante di Freund incompleto, rispettivamente.
- Rilevare i titoli anticorpali contro l'APN nel siero di questi topi mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico indiretto (ELISA) utilizzando una piastra per microtitolazione rivestita con 5 μg/mL di proteina APN diluita in 0,05 M PBS (pH 9,6).
2. Tecnologia degli ibridomi per produrre anticorpi monoclonali contro APN
- Iniettare intraperitonealmente (i.p.) 100 μg di proteina APN nei topi selezionati per un potenziamento finale dell'antigene.
- Tre giorni dopo, sopprimere i topi usando pentobarbital sodico (50 mg/kg, v/v, intraperitoneale) e lussazione cervicale.
- Raccogliere la milza e lavare due volte con DMEM per rimuovere il sangue e le cellule adipose. Filtrare la sospensione di cellule della milza utilizzando una griglia di rame a 200 maglie per rimuovere i detriti tissutali e raccogliere le cellule della milza utilizzando la centrifugazione (1500 × g, 10 min) per rimuovere la membrana della milza.
- Seminare cellule di mieloma di topo SP2/0 in un pallone da 25 cm2 contenente 5 ml di terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 6% di siero fetale bovino (FBS) e coltura a 37 °C, 6% di CO2 atmosfera per mantenere la vitalità cellulare. Dopo 5-6 giorni di coltura, le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza dopo la rianimazione e sono in fase di log di crescita. Al microscopio, le cellule sono rotonde, luminose e chiare.
- Un giorno prima dell'ibridazione, raccogliere i macrofagi dalle cavità peritoneali dei topi secondo un metodo precedentemente pubblicato.
- Seminare macrofagi peritoneali a una densità di 0,1-0,2 × 105/mL in piastre a 96 pozzetti, ciascuna contenente 100 μL di terreno HAT (DMEM integrato con il 10% di FBS e 1x HAT Supplement), e incubare a 37 °C, 6% di CO2 in atmosfera umidificata durante la notte.
- Per l'ibridazione, aspirare delicatamente le cellule SP2/0 con una pipetta da 8-10 flaconi e sospenderle in 10 mL di terreno DMEM privo di siero. Lavare le celle con DMEM fresco, centrifugare (1500 × g, 10 min) due volte, quindi risospendere in 10 mL di DMEM.
- Mescolare le cellule quantificate della milza con le cellule SP2/0 in un rapporto di 10:1 e trasferirle in provette da 50 mL. Centrifugare (1500 × g, 10 min) ed eliminare il surnatante. Raccogliere i pellet cellulari sul fondo dei tubi e picchiettare con il palmo della mano per allentare i pellet prima dell'ibridazione.
- Aggiungere 1 mL di polietilenglicole 1500 (PEG 1500), preriscaldato a 37 °C, goccia a goccia utilizzando un contagocce sul pellet di cellule allentate per un periodo di tempo di 45 s mentre si ruota delicatamente il fondo della provetta.
- Aggiungere lentamente 1 mL di DMEM preriscaldato a 37 °C alla miscela di cui sopra per un periodo di 90 s, seguito da altri 30 mL di DMEM fresco. Immergere il tubo di fusione in un bagnomaria a 37 °C per 30 minuti.
- Dopo l'incubazione nel bagno caldo, raccogliere le cellule e risospenderle in terreno HAT. Quindi coltura in una piastra a 96 pozzetti inoculata con macrofagi peritoneali.
- Cinque giorni dopo, aggiungere 100 μL di terreno HAT fresco a ciascun pozzetto e incubare la piastra per altri 5 giorni, dopodiché sostituire il terreno con un terreno HT (DMEM integrato con il 10% di FBS e 1x HT Supplement).
- Utilizzare una piastra per microtitolazione rivestita con 5 μg/mL di proteina APN diluita in 0,05 M PBS (pH 9,6) per analizzare gli anticorpi monoclonali nel surnatante dell'ibridoma utilizzando il test ELISA.
- Quando il terreno nei pozzetti della piastra a 96 pozzetti diventa giallo (a causa della crescita cellulare e del rilascio di metaboliti, il pH nel terreno scende a 6,8 e il rosso fenolo passa dal fucsia al giallo) o si osservano cluster di cellule, acquisire 100 μL di surnatante dai pozzetti selezionati e aggiungerlo ai pozzetti della piastra ELISA rivestita. Utilizzare un lettore di micropiastre per misurare i valori OD450.
- Utilizzare gli anticorpi policlonali contro l'APN e il siero di topo non infetto rispettivamente come controllo positivo e negativo e utilizzare il PBS come controllo in bianco. In questo studio, il rapporto OD450 tra campione e controllo negativo (P/N) ≥ 2,1 è stato riconosciuto come standard di selezione positiva.
