Un metodo per produrre anticorpi ricombinanti contro la metallopeptidasi

Abstract

Fonte: Xia, P. et al., Produzione di anticorpi monoclonali che hanno come bersaglio l'aminopeptidasi N nell'epitelio della mucosa intestinale suina.J. Vis. Exp.(2021)

Questo video mostra una procedura per la produzione di anticorpi ricombinanti contro la metallopeptidasi. I plasmidi ricombinanti che trasportano i geni per l'anticorpo, la proteina fluorescente verde e la resistenza agli antibiotici vengono trasfettati in cellule epiteliali con lipofectamina. Le cellule trasfettate vengono selezionate e coltivate per generare anticorpi ricombinanti.

Protocollo

1. Preparazione dell'antigene proteico dell'aminopeptidasi suina N (APN)

NOTA: Il ceppo pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) e le cellule stabilmente espresse APN pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 sono state costruite in uno studio precedente.

1. Recuperare i batteri da uno stock di glicerolo congelato e striare su piastre Luria-Bertani (LB) contenenti 50 μg/mL di kanamicina (Km⁺) per l'isolamento di una singola colonia.
2. Selezionare una singola colonia dalla piastra appena striata, coltivare in 4 mL di terreno LB (10 g/L di triptone, 10 g/L di cloruro di sodio (NaCl) e 5 g/L di estratto di lievito, pH 7,2) integrato con Km⁺ (50 μg/mL) e lasciare crescere per una notte (12-16 h) con agitazione (178 giri/min) a 37 °C.
3. Diluire i batteri preparati a 1:100 in brodo fresco Km⁺ LB e incubare a 37 °C agitando per 2-3 ore fino a quando l'OD₆₀₀ raggiunge 0,4-0,6.
4. Aggiungere isopropil β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) al terreno fino a una concentrazione finale di 0,4 mM e incubare le colture per altre 10 ore a 16 °C.
5. Di conseguenza, centrifugare e raccogliere i batteri utilizzando l'induzione IPTG (10.000 × g, 4 °C 15 min).
6. Risospendere il pellet cellulare utilizzando 5 mL di tampone LEW (Lisi/Equilibrio/Lavaggio) (50 mM di fosfato di sodio anidro monobasico (NaH₂PO₄) e 300 mM di NaCl, pH 8,0) contenente 1 mg/mL di lisozima. Mescolare la sospensione batterica per 30 minuti sul ghiaccio e sonicare completamente (15 s pulse e 20 s off, 15 min) utilizzando un omogeneizzatore a ultrasuoni.
7. Centrifugare il lisato di cellule grezze a 4 °C e 10.000 × g per 30 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in una colonna pre-equilibrata e incubare 1-2 minuti prima del drenaggio per gravità. Ripeti questo passaggio tre volte.
8. Lavare la colonna con 20 mL di tampone LEW e drenarla per gravità. Eluire la proteina APN marcata con istidina utilizzando 9 mL di tampone di eluizione (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl e 250 mM imidazolo, pH 8,0) e raccoglierla nel tubo di dialisi.
9. Dializzare la soluzione proteica per una notte a 4 °C in tampone carbonato di sodio-bicarbonato di sodio (soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 135 mM di NaCl, 4,7 mM di cloruro di potassio, 2 mM di NaH₂PO₄ e 10 mM di fosfato di sodio bibasico, pH 7,2).
10. Analizzare utilizzando un gel SDS-PAGE al 12,0% e western blotting per valutare la purezza della proteina APN.
    1. Caricare 5 μg di proteine in ciascun pozzetto del gel e lasciarlo funzionare a 110 V per 1,5 ore. Quindi, trasferire la proteina su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) per 50 minuti a 15 V. Determinare la concentrazione della proteina purificata utilizzando un test di acido bicinconnico (BCA).

2. Immunizzazione animale

1. Per via sottocutanea (s.c.) iniettare topi femmina BALB/c, di 6-8 settimane di età, con 50 μg di proteina APN o PBS (controllo negativo) miscelati con adiuvanti una volta ogni 2 settimane. Utilizzare l'adiuvante di Freund completo che contiene i micobatteri uccisi dal calore per l'immunizzazione iniziale e l'adiuvante di Freund incompleto per le immunizzazioni di richiamo. Mescolare volumi uguali di proteina APN (o PBS) e adiuvante di Freund o adiuvante di Freund incompleto, rispettivamente.
2. Rilevare i titoli anticorpali contro l'APN nel siero di questi topi mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico indiretto (ELISA) utilizzando una piastra per microtitolazione rivestita con 5 μg/mL di proteina APN diluita in 0,05 M PBS (pH 9,6).

3. Tecnologia degli ibridomi per produrre anticorpi monoclonali contro APN

1. Iniettare intraperitonealmente (i.p.) 100 μg di proteina APN nei topi selezionati per un potenziamento finale dell'antigene.
2. Tre giorni dopo, sopprimere i topi usando pentobarbital sodico (50 mg/kg, v/v, intraperitoneale) e lussazione cervicale.
3. Raccogli la milza e lava due volte con il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco per rimuovere il sangue e le cellule adipose. Filtrare la sospensione di cellule della milza utilizzando una griglia di rame a 200 maglie per rimuovere i detriti tissutali e raccogliere le cellule della milza utilizzando la centrifugazione (1500 × g, 10 min) per rimuovere la membrana della milza.
4. Seminare cellule di mieloma di topo SP2/0 in un pallone da 25 cm² contenente 5 mL di DMEM integrato con il 6% di siero fetale bovino (FBS) e coltura a 37 °C, 6% di atmosfera di anidride carbonica (CO₂) per mantenere la vitalità cellulare. Dopo 5-6 giorni di coltura, le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza dopo la rianimazione e sono in fase di log di crescita. Al microscopio, le cellule sono rotonde, luminose e chiare.
5. Un giorno prima dell'ibridazione, raccogliere i macrofagi dalle cavità peritoneali dei topi secondo un metodo precedentemente pubblicato.
6. Seminare macrofagi peritoneali a una densità di 0,1-0,2 × 10⁵/mL in piastre a 96 pozzetti, ciascuna contenente 100 μL di terreno ipoxantina-amminoterina-timidina (HAT) (DMEM integrato con il 10% di FBS e 1x HAT Supplement), e incubare a 37 °C, 6% di CO₂ in atmosfera umidificata durante la notte.
7. Per l'ibridazione, aspirare delicatamente le cellule SP2/0 con una pipetta da 8-10 flaconi e sospenderle in 10 mL di terreno DMEM privo di siero. Lavare le celle con DMEM fresco, centrifugare (1500 × g, 10 min) due volte, quindi risospendere in 10 mL di DMEM.
8. Mescolare le cellule quantificate della milza con le cellule SP2/0 in un rapporto di 10:1 e trasferirle in provette da 50 mL. Centrifugare (1500 × g, 10 min) ed eliminare il surnatante. Raccogliere i pellet cellulari sul fondo dei tubi e picchiettare con il palmo della mano per allentare i pellet prima dell'ibridazione.
9. Aggiungere 1 mL di polietilenglicole 1500 (PEG 1500), preriscaldato a 37 °C, goccia a goccia utilizzando un contagocce sul pellet di cellule allentate per un periodo di tempo di 45 s mentre si ruota delicatamente il fondo della provetta.
10. Aggiungere lentamente 1 mL di DMEM preriscaldato a 37 °C alla miscela di cui sopra per un periodo di 90 s, seguito da altri 30 mL di DMEM fresco. Immergere il tubo di fusione in un bagnomaria a 37 °C per 30 minuti.
11. Dopo l'incubazione nel bagno caldo, raccogliere le cellule e risospenderle in terreno HAT. Quindi coltura in una piastra a 96 pozzetti inoculata con macrofagi peritoneali.
12. Cinque giorni dopo, aggiungere 100 μL di terreno HAT fresco a ciascun pozzetto e incubare la piastra per altri 5 giorni, dopodiché sostituire il terreno con un terreno HT (DMEM integrato con il 10% di FBS e 1x HT Supplement).
13. Utilizzare una piastra per microtitolazione rivestita con 5 μg/mL di proteina APN diluita in 0,05 M PBS (pH 9,6) per analizzare gli anticorpi monoclonali nel surnatante dell'ibridoma utilizzando il test ELISA.
    1. Quando il terreno nei pozzetti della piastra a 96 pozzetti diventa giallo (a causa della crescita cellulare e del rilascio di metaboliti, il pH nel terreno scende a 6,8 e il rosso fenolo passa dal fucsia al giallo) o si osservano cluster di cellule, acquisire 100 μL di surnatante dai pozzetti selezionati e aggiungerlo ai pozzetti della piastra ELISA rivestita. Utilizzare un lettore di micropiastre per misurare i valori di densità ottica 450 (OD450).
    2. Utilizzare gli anticorpi policlonali contro l'APN e il siero di topo non infetto rispettivamente come controllo positivo e negativo e utilizzare il PBS come controllo in bianco. In questo studio, il rapporto OD450 tra campione e controllo negativo (P/N) ≥ 2,1 è stato riconosciuto come standard di selezione positiva.
14. Dopo tre cicli consecutivi di selezione positiva, selezionare l'ibridoma che mostra una maggiore risposta sierologica contro la proteina APN per un test di diluizione limitata.
    1. Preparare i macrofagi peritoneali e seminare in piastre a 96 pozzetti come descritto in precedenza.
    2. Sospendere le cellule di ibridoma in terreno HT a una media di 0,5-2 cellule per pozzetto e la coltura in un incubatore a 37 °C, 6% CO₂. Ripetere questo passaggio tre o quattro volte fino a quando il tasso di positività indicato dal test immunologico ELISA raggiunge il 100%.
15. Sotto la pressione del congelamento e dello scongelamento continuo, selezionare le cellule di ibridoma positive in grado di secernere stabilmente anticorpi anti-APN e proliferare normalmente.
    1. Somministrare una singola iniezione i.p. di 0,3 mL di pristane a ciascun topo (8-10 settimane). A 10 giorni dalla somministrazione di pristine, iniettare in ciascun topo 2-5 x 10⁵ cellule di ibridoma in 0,5 ml di PBS (pH 7,2).
    2. Raccogliere con cura il liquido peritoneale dalla cavità peritoneale di questi topi da 8 a 10 giorni dopo l'iniezione.
    3. Raccogliere i surnatanti mediante centrifugazione a 5.000 × g per 15 minuti e purificare gli anticorpi nei surnatanti utilizzando la precipitazione di solfato di ammonio saturo al 33% [(NH₄)₂SO₄] e l'agarosio della proteina A.

4. Caratterizzazione di anticorpi monoclonali (mAb) contro la proteina APN

1. Determinare il sottotipo di immunoglobulina degli anticorpi monoclonali raccolti utilizzando un sistema di clonotipizzazione SBA-HRP. Utilizzare SDS-PAGE e western blotting per valutare la purezza e la specificità degli anticorpi monoclonali.
2. Analizzare la specificità dell'epitopo degli anticorpi monoclonali rispetto alla proteina APN utilizzando ELISA. Il valore di additività (AV) è il rapporto tra_{gli anticorpi monoclonali OD (a+b)} e (_{mAb OD-a}+_mAb OD), che viene utilizzato per valutare se gli anticorpi monoclonali riconoscono lo stesso sito antigenico; Gli_{anticorpi monoclonali OD-a} e gli_anticorpi monoclonali OD b rappresentano i valori OD450 di diversi anticorpi monoclonali contro il solo APN, mentre gli_{anticorpi monoclonali OD (a+b)} rappresentano i valori OD450 di una miscela 1:1 di due anticorpi monoclonali contro APN.
   1. Valutare ogni campione almeno quattro repliche e ripetere l'intero esperimento almeno tre volte.

5. Espressione di rAbs rispetto ad APN

1. Estrarre l'RNA totale dalle cellule di ibridoma e dalla milza sopra menzionate di topi immunizzati con APN (ad es. TRIzol). Sintetizzare il DNA complementare (cDNA) utilizzando un kit di sintesi del cDNA secondo le istruzioni del produttore.
2. Amplificare le regioni variabili degli anticorpi monoclonali utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) nidificata e determinare le sequenze di catene pesanti (VH) e catene leggere (VL) utilizzando il sequenziamento. Analizzare i geni che codificano VH e VL utilizzando lo strumento di analisi del genoma del topo IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
3. Combinare i geni VH e VL con sequenze leader e subclonarli in sequenza nei vettori pET28a (+) e pIRES2-ZsGreen1, rispettivamente, utilizzando la tecnologia di clonazione senza soluzione di continuità per consentire l'inserimento di frammenti di DNA senza cicatrici. Gli inneschi specifici sono elencati nella Tabella 1.
4. Far crescere i batteri trasformati pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 in presenza di 0,4 mM di IPTG in agitatori orbitali a 37 °C per 10 ore. Quindi indurre, purificare e valutare l'espressione della proteina rAbs utilizzando la purificazione proteica di routine.
5. Seminare 100 μl di 0,5 x 10⁵ cellule CHO per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti e incubare a 37 °C in un'atmosfera di CO₂ al 6% per 18-24 ore. Quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, diluire il plasmide pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN con Opti-MEM a una concentrazione finale di 0,1 μg/μL e incubare 5 minuti a temperatura ambiente prima di utilizzarlo per la trasfezione.
6. Miscelare delicatamente 50 μL di plasmide diluito pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN con 1 μL di Lipofectamine 2000 e 49 μL di Opti-MEM e incubare la miscela per altri 20 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 100 μl di miscela a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenente cellule CHO e incubare a 37 °C in atmosfera di CO₂ al 6% per 4-6 ore.
7. A 4-6 ore dalla trasfezione, sostituire il terreno con un terreno DMEM-F12 integrato con il 10% di FBS e incubare la piastra per altre 48 ore. Quindi, aggiungere 400 μg/mL di G418 a ciascun pozzetto per selezionare le cellule trasfettate in modo stabile.
8. Dopo 10 giorni di selezione con DMEM-F12 addizionato con FBS al 10% e 400 μg/mL G418, selezionare le cellule (3,0 × 10⁷ cellule/mL) mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Circa il 10-15% della popolazione cellulare era positiva.
9. Diluite in serie le cellule positive raccolte, seminate a una media di 0,5-2 cellule per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti e coltivate in un incubatore a 37 °C, 6% di CO₂. Mantenere le cellule pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO trasfettate in modo stabile utilizzando la selezione con G418 (200 μg/mL).
10. La concentrazione di FBS nel terreno di coltura cellulare sopra descritto diminuisce gradualmente dal 10% allo 0% durante la fase di crescita logaritmica per un periodo di tempo di 3 settimane. Quindi, adattare le cellule CHO aderenti alla crescita in sospensione in un mezzo privo di siero.
11. Coltura delle cellule pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO seminate nella fase di crescita logaritmica in terreno privo di siero a una densità di 0,8-1,0 × 10⁵ cellule/mL in palloni di agitazione a 80-110 giri/min di velocità di agitazione e 37°C, 6% CO₂.
12. Raccogliere la sospensione cellulare ogni 12 ore per determinare i cambiamenti nella vitalità e nella vitalità cellulare utilizzando un kit per il conteggio delle cellule (ad es. CCK-8) secondo le istruzioni del produttore.
13. L'espressione degli anticorpi raggiunge i livelli di picco quando la vitalità cellulare diminuisce all'80% e la densità cellulare raggiunge 1,0-2,0 ×^10-6 cellule/mL. Raccogliere i surnatanti cellulari mediante centrifugazione, filtrare utilizzando un filtro a membrana in politetrafluoroetilene da 0,22 μm e purificare utilizzando l'agarosio proteico A.
14. Confermare la produzione di anticorpi specifici per APN utilizzando saggi di immunofluorescenza indiretta (IFA).
15. Determinare i titoli anticorpali e le affinità di legame utilizzando il test ELISA come descritto in precedenza. Calcolare la costante di dissociazione di equilibrio (valore K_D) degli anticorpi con un'equazione logistica a quattro parametri utilizzando il software.

Tabella 1. I primer specifici utilizzati in questo studio.

abbecedario	Sequenza (5'-3')
VH-VL-F	CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG
VH-VL-R	CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT
pET28a (+)-F	TCCACCAGTCATGCTAGCCATAAACGGTCGTGATTCGA
pET28a (+)-R	CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC
pIRES2-ZsGreen1-F	CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA
pIRES2-ZsGreen1-R	GGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Coadiuvante completo di Freund	Sigma-Aldrich	F5881	Immunizzazione animale
DAPI	Beyotime Biotecnologie	C1002	Contromacchia nucleare
DMEM	Gibco	11965092	Coltura cellulare
DMEM-F12	Gibco	12634010	Coltura cellulare
Anticorpo secondario IgG anti-topo di capra coniugato Dylight 549	Abbkine	Codice A23310	Analisi di immunofluorescenza indiretta
Kit di conteggio cellulare migliorato-8	Beyotime Biotecnologie	Codice: C0042	Misurazione della vitalità e della vitalità cellulare
Siero fetale bovino	Gibco	Codice 10091	Coltura cellulare
Antibiotico selettivo Geneticin™	Gibco	11811098	Antibiotico selettivo
Supplemento CAPPELLO (50X)	Gibco	21060017	Selezione delle celle
Supplemento HT (100X)	Gibco	11067030	Selezione delle celle
Coadiuvante di Freund incompleto	Sigma-Aldrich	F5506	Immunizzazione animale
Isopropil β-d-1-tiogalattopiranoside	Sigma-Aldrich	I5502	Espressione proteica
Kanamicina	Beyotime Biotecnologie	ST102	Antibiotico battericida
Microscopio confocale Leica TCS SP8 STED	Leica Microsystems	SP8 STED	Imaging a fluorescenza
Reagente Lipofectamina® 2000	Thermofisher	11668019	Trasfezione
LSRFortessa™ smistamento cellulare attivato da fluorescenza	Bd	FACS LSRFortessa	Citometria a flusso
Lettore di micropiastre	BioTek	SCATOLA 998	Analisi ELISA
Micro spettrofotometro	Thermo Fisher	Nano Drop uno	Rilevamento della concentrazione di acidi nucleici
NaCl	Reagente chimico Sinopharm	10019308	Brodo di coltura
(NH4)2SO4	Reagente chimico Sinopharm	10002917	Brodo di coltura
Opti-MEM	Gibco	31985088	Coltura cellulare
Polietilenglicole 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Fusione cellulare
Kit di sintesi di cDNA a 1° filamento PrimeScript™	Takara Bio	RR047	qPCR
Proteina A agarosio	Beyotime Biotecnologie	P2006	Purificazione delle proteine degli anticorpi
Protino® Ni+-TED 2000 Colonne impaccate	MACHEREY-NAGEL	Codice: 745120.5	Purificazione delle proteine
Sistema di clonotipizzazione SBA-HRP	Biotecnologie del sud	Mag-00	Isotipizzazione di anticorpi monoclonali di topo
Kit di clonazione senza soluzione di continuità	Beyotime Biotecnologie	D7010S	Costruzione di plasmidi
Agitare i palloni	Beyotime Biotecnologie	E3285	Coltura cellulare
Tampone carbonato di sodio-bicarbonato di sodio	Beyotime Biotecnologie	C0221A	Coltura cellulare
Cella di trasferimento semi-secca Trans-Blot SD	Bio-rad	Codice 170-3940	Western blot
Triptone	Ossoide	LP0042	Brodo di coltura
Omogeneizzatore ad ultrasuoni	Ningbo Xinzhi Biotecnologia	JY92-IIN	Omogeneizzazione dei campioni
Estratto di lievito	Ossoide	LP0021	Brodo di coltura
Micropiastra a 96 pozzetti	Corning	3599	Coltura cellulare