Un metodo per produrre anticorpi ricombinanti contro la metallopeptidasi

Abstract

Fonte: Xia, P. et al., Produzione di anticorpi monoclonali che hanno come bersaglio l'aminopeptidasi N nell'epitelio della mucosa intestinale suina.J. Vis. Exp.(2021)

Questo video mostra una procedura per la produzione di anticorpi ricombinanti contro la metallopeptidasi. I plasmidi ricombinanti che trasportano i geni per l'anticorpo, la proteina fluorescente verde e la resistenza agli antibiotici vengono trasfettati in cellule epiteliali con lipofectamina. Le cellule trasfettate vengono selezionate e coltivate per generare anticorpi ricombinanti.

Protocollo

1. Preparazione dell'antigene proteico dell'aminopeptidasi suina N (APN)

NOTA: Il ceppo pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) e le cellule stabilmente espresse APN pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 sono state costruite in uno studio precedente.

1. Recuperare i batteri da uno stock di glicerolo congelato e striare su piastre Luria-Bertani (LB) contenenti 50 μg/mL di kanamicina (Km⁺) per l'isolamento di una singola colonia.
2. Selezionare una singola colonia dalla piastra appena striata, coltivare in 4 mL di terreno LB (10 g/L di triptone, 10 g/L di cloruro di sodio (NaCl) e 5 g/L di estratto di lievito, pH....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Coadiuvante completo di Freund	Sigma-Aldrich	F5881	Immunizzazione animale
DAPI	Beyotime Biotecnologie	C1002	Contromacchia nucleare
DMEM	Gibco	11965092	Coltura cellulare
DMEM-F12	Gibco	12634010	Coltura cellulare
Anticorpo secondario IgG anti-topo di capra coniugato Dylight 549	Abbkine	Codice A23310	Analisi di immunofluorescenza indiretta
Kit di conteggio cellulare migliorato-8	Beyotime Biotecnologie	Codice: C0042	Misurazione della vitalità e della vitalità cellulare
Siero fetale bovino	Gibco	Codice 10091	Coltura cellulare
Antibiotico selettivo Geneticin™	Gibco	11811098	Antibiotico selettivo
Supplemento CAPPELLO (50X)	Gibco	21060017	Selezione delle celle
Supplemento HT (100X)	Gibco	11067030	Selezione delle celle
Coadiuvante di Freund incompleto	Sigma-Aldrich	F5506	Immunizzazione animale
Isopropil β-d-1-tiogalattopiranoside	Sigma-Aldrich	I5502	Espressione proteica
Kanamicina	Beyotime Biotecnologie	ST102	Antibiotico battericida
Microscopio confocale Leica TCS SP8 STED	Leica Microsystems	SP8 STED	Imaging a fluorescenza
Reagente Lipofectamina® 2000	Thermofisher	11668019	Trasfezione
LSRFortessa™ smistamento cellulare attivato da fluorescenza	Bd	FACS LSRFortessa	Citometria a flusso
Lettore di micropiastre	BioTek	SCATOLA 998	Analisi ELISA
Micro spettrofotometro	Thermo Fisher	Nano Drop uno	Rilevamento della concentrazione di acidi nucleici
NaCl	Reagente chimico Sinopharm	10019308	Brodo di coltura
(NH4)2SO4	Reagente chimico Sinopharm	10002917	Brodo di coltura
Opti-MEM	Gibco	31985088	Coltura cellulare
Polietilenglicole 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Fusione cellulare
Kit di sintesi di cDNA a 1° filamento PrimeScript™	Takara Bio	RR047	qPCR
Proteina A agarosio	Beyotime Biotecnologie	P2006	Purificazione delle proteine degli anticorpi
Protino® Ni+-TED 2000 Colonne impaccate	MACHEREY-NAGEL	Codice: 745120.5	Purificazione delle proteine
Sistema di clonotipizzazione SBA-HRP	Biotecnologie del sud	Mag-00	Isotipizzazione di anticorpi monoclonali di topo
Kit di clonazione senza soluzione di continuità	Beyotime Biotecnologie	D7010S	Costruzione di plasmidi
Agitare i palloni	Beyotime Biotecnologie	E3285	Coltura cellulare
Tampone carbonato di sodio-bicarbonato di sodio	Beyotime Biotecnologie	C0221A	Coltura cellulare
Cella di trasferimento semi-secca Trans-Blot SD	Bio-rad	Codice 170-3940	Western blot
Triptone	Ossoide	LP0042	Brodo di coltura
Omogeneizzatore ad ultrasuoni	Ningbo Xinzhi Biotecnologia	JY92-IIN	Omogeneizzazione dei campioni
Estratto di lievito	Ossoide	LP0021	Brodo di coltura
Micropiastra a 96 pozzetti	Corning	3599	Coltura cellulare