Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Isolamento di PBMC e arricchimento/purificazione di cellule NK
NOTA: Possono essere eseguiti anche altri metodi per l'isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e l'arricchimento/purificazione.
- Prelevare 200 mL di sangue in condizioni regolamentate in una provetta contenente eparina.
- Aggiungere 15 mL del terreno del gradiente di densità in una provetta da 50 mL con una barriera porosa incorporata. Centrifugare il tubo a 1000 x g per 30 s.
- Aggiungere 12,5 mL di sangue nella provetta, seguiti da altri 12,5 mL di PBS, e capovolgere delicatamente 3 volte. Far girare la provetta a 800 x g per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) senza interruzioni.
- Preparare una provetta conica da 50 mL con 40 mL di PBS per ogni provetta con una barriera porosa mentre le cellule girano.
- Rimuovere con cautela le provette e ispezionarle dopo la centrifugazione. Verificare la presenza di uno strato sottile e visibilmente bianco di PBMC al di sopra della barriera porosa, tra le demarcazioni di 20 mL e 25 mL sulla provetta da 50 mL.
- Rimuovere con cautela quanto più liquido possibile dalla parte superiore utilizzando una pipetta senza disturbare il sottile strato bianco di PBMC.
- Con una pipetta sierologica pulita da 10 ml, rimuovere delicatamente lo strato di PBMC oltre allo strato di liquido chiaro e giallastro fino al filtro della provetta.
- Espellere le PBMC e il liquido nel conico da 50 mL contenente PBS preparato al punto 1.4. Centrifugare i tubi a RT e 300 x g per 5 min.
- Aspirare il lavaggio PBS e aggiungere altri 40 ml di PBS. Centrifugare i tubi a RT e 300 x g per 5 min.
- Dopo il lavaggio, contare le cellule e risospenderle in 40 μL di BSA/PBS al 2% per 1 x 107 cellule.
- Procedere all'isolamento delle cellule NK utilizzando il metodo scelto. Le opzioni disponibili includono lo smistamento manuale o automatizzato basato su microsfere magnetiche. È inoltre possibile eseguire la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.
- Rimuovere una piccola aliquota di cellule per determinare la purezza delle cellule NK mediante citometria a flusso. La strategia di gating include quanto segue: gate su cellule vive in base al profilo di dispersione in avanti rispetto a quello laterale, quindi valutare la purezza in base ai marcatori NK (ad esempio, CD3, CD56) nella specifica popolazione viva. La purezza tipica è del >95%.
- Al termine dell'isolamento, centrifugare le celle a RT e 300 x g per 5 minuti per pellettare e aspirare.
- Risospendere il pellet cellulare a 1 x 107 cellule/mL in RPMI 1640 con sostanze nutritive, FBS inattivato al calore al 10%, 1 mM di piruvato di sodio, 55 mM 2-ME e 10 mM di HEPES (pH = 7,2).
2. Attivazione mediata da anticorpi delle cellule NK tramite FcγRIIIa
- Impostare una microcentrifuga refrigerata a 4 °C.
- Erogare 1 x 106 (100 μL di) cellule NK risospese in una o più provette da 1,5 mL e metterle sul ghiaccio.
nota: Le cellule possono essere dispensate in una piastra con fondo a U a 96 pozzetti se sono presenti numerosi campioni.
- Preparare 1 μL di 100 μg/mL di rituximab (o anticorpo di interesse) per campione e aggiungere 1 μL alle cellule per ottenere una concentrazione finale di 1 μg/mL di anticorpo.
nota: Altre molecole possono essere aggiunte alle cellule a questo punto o prima per la valutazione degli effetti di combinazione. Qui, ritixumab è stato utilizzato per la stimolazione. In studi precedenti, inibitori di piccole molecole sono stati aggiunti alle stimolazioni.
- Incubare il campione su ghiaccio per 30 minuti. Durante l'incubazione, preparare 50 μl di anticorpo anti-catena leggera κ umana da 50 μg/mL per campione in terreno e riscaldare a 37 °C su un blocco termico o in un bagno d'acqua.
- Dopo l'incubazione delle cellule su ghiaccio, aggiungere 1 mL di terreno ghiacciato e centrifugare a 135 x g per 5 minuti a 4 °C. Lavare nuovamente con 1 mL di terreno ghiacciato.
- Aspirare il surnatante dopo l'ultimo lavaggio e aggiungere 50 μl della miscela di catene leggere κ umane preparata al punto 2.4.
- Incubare immediatamente i campioni per i punti temporali determinati dall'utente finale a 37 °C su un blocco termico o in un bagno d'acqua.
- Interrompere la stimolazione aggiungendo 1 mL di terreno ghiacciato e centrifugare immediatamente i campioni in una centrifuga refrigerata a 135 x g per 5 minuti. Lavare nuovamente con 1 mL di terreno ghiacciato.
