Una tecnica per generare anticorpi monoclonali da cellule B antigene-specifiche

Abstract

Fonte: Devilder, M., et al. Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminanti da rare cellule B specifiche per l'antigene circolanti nel sangue. (2018).

Il video mostra una tecnica per generare anticorpi monoclonali da cellule B antigene-specifiche. I vettori di espressione eucariotici che codificano per le catene pesanti e leggere di anticorpi, clonati da cellule B isolate antigene-specifiche, vengono introdotti nelle cellule di mammifero utilizzando poliplex. Una volta all'interno delle cellule, questi vettori subiscono la traduzione e i peptidi a catena pesante e leggera risultanti si assemblano in anticorpi, che vengono successivamente secreti dalle cellule.

Protocollo

1. Produzione di anticorpi monoclonali

1. Il giorno prima della trasfezione, è stato seminato 15.000 cellule di rene embrionale umano 293A (HEK 293A) in 200 μL di terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di FBS per pozzetto in piastre da 96 pozzetti. Incubare per una notte in un incubatore di CO₂ (5% CO₂) a 37 °C.
2. Cotrasfettare le cellule 293A in terreno DMEM contenente il 10% di FBS utilizzando un derivato lineare della polietilenimmina come reagente di trasfezione.
   nota: Eseguire la trasfezione in triplice copia. Il seguente protocollo è per un pozzetto di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti.
   1. Diluire 0,5 μL di reagente di trasfezione del DNA in 10 μL di NaCl 150 mM. Diluire 0,125 μg di vettori esprimenti catene pesanti variabili (vH) e 0,125 μg di catene leggere variabili (vL) in 10 μL di NaCl 150 mM. Agitare ogni diluizione per 10 s.
   2. Aggiungere 10 μl di reagente di trasfezione di DNA diluito nella soluzione di DNA da 10 μl. Agitare 15 s e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere la miscela da 20 μl goccia a goccia sulle cellule 293A e mescolare facendo roteare delicatamente la piastra.
3. Sostituire il terreno 16 ore dopo la trasfezione e coltivare le cellule per 5 giorni in terreno privo di siero.
   nota: Utilizzare un terreno privo di siero per evitare che le immunoglobuline sieriche (Igs) contaminino gli anticorpi prodotti.
4. Eliminare cellule e detriti mediante centrifugazione a 460 x g per 5 min.
5. Raccogliere i surnatanti per aspirazione con una pipetta multicanale e trasferirli in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V.
6. Rivestire l'Ag pertinente per una notte a 4 °C in 100 μL per pozzetto di tampone di rivestimento ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)/ELISPOT (Enzyme-Linked Immunosorbent Spot) 1x a una concentrazione finale di 2 μg/mL in piastre ELISA a 96 pozzetti.
7. Bloccare i pozzetti con il 10% di terreno FBS DMEM per 2 ore a 37 °C.
8. Aggiungere 50 μL di surnatanti di cellule 293A trasfettate dal passaggio 1.5 e incubare per 2 ore a RT.
9. Aggiungere 100 μL di un anticorpo anti-immunoglobulina G umana (IgG Ab) coniugato all'enzima perossidasi di rafano (HRP) a 1 μg/mL e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Aggiungere 50 μL di substrato cromogenico (3,3',5,5' tetrametilbenzidina, TMB) e incubare per 20 minuti.
10. Lettura delle densità ottiche a 450 nm su uno spettrofotometro.
    nota: Gli anticorpi monoclonali specifici rivelati dal test ELISA possono essere ulteriormente prodotti su larga scala e purificati su colonna di proteina A che presenta affinità per le IgG umane.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Linea cellulare HEK 293A	Thermo Fisher scientifico	Codice: R70507
DMEM (1X) Aquila modificata di Dulbecco media	Tecnologie Gibco by life	Codice 21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucosio 0,11g/L Piruvato di Sodio (-) L-Glutmina
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
Siero fetale bovino (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Reagente per trasfezione di DNA Jet PEI	PolyPlus	101-40
Piastra a fondo piatto96 pozzetti	Falcone	353072
Piastra a 96 pozzetti con fondo a V	Nunc/Thermofisher	Codice: 55142