Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dei cateteri Step
- Preparazione di un tubo di silice fusa per il gradino del catetere
- Tagliare il capillare di silice fusa con un diametro interno di 0,1 mm e uno spessore della parete di 0,0325 mm a una lunghezza di 30 mm.
- Esaminare il tubo alla ricerca di crepe e lucidare a caldo le estremità utilizzando una microforgia per assicurarsi che le aperture del tubo abbiano una superficie liscia.
- Fissaggio della camera d'aria in un ago metallico
- Monta un ago da 27 G su una siringa da 10 μL e posiziona la siringa in un robot stereotassico.
- Usando il robot, sposta la siringa su una superficie dura e toccala con la punta dell'ago. Questa posizione deve essere annotata o salvata nel software perché servirà come superficie di riferimento per impostare la lunghezza del passo del catetere.
- Sollevare l'ago per consentire il posizionamento del capillare di silice fusa all'interno dell'ago.
- Posizionare il capillare di silice fusa nell'ago in modo che 20 mm di capillare sporgano dall'ago.
- Utilizzando una pipetta, distribuire uniformemente 2 μl di adesivo cianoacrilato ad alta viscosità sul capillare, partendo dall'ago metallico e terminando 10 mm sopra l'estremità inferiore del capillare, come illustrato nella Figura 1.
- Utilizzando il robot stereotassico, abbassare l'ago fino a quando la punta dell'ago metallico si trova a 1 mm sopra la superficie di riferimento. In questo modo, il capillare di silice fusa verrà fissato nell'ago metallico, formando un passo di 1 mm dalla punta. Rimuovere l'eccesso di colla che si forma all'estremità dell'ago di metallo per evitare di smussare il gradino.
- Attendere 15 minuti affinché la colla si indurisca e rimuovere la siringa con il catetere dal robot stereotassico. Verificare che tutta la colla in eccesso sia stata rimossa al passaggio controllando la punta del catetere al microscopio.
- Test del catetere a gradini utilizzando un blocco di agarosio
- Preparare una soluzione di agarosio allo 0,6% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in un vassoio di gel convenzionale e attendere che polimerizzi. Tagliare l'agarosio in blocchi di circa 20 mm x 20 mm. Fino all'utilizzo, mantenere i blocchi immersi nel PBS.
- Riempire manualmente la siringa del catetere a gradini con 10 μl di soluzione allo 0,4% di blu di tripano filtrato.
- Utilizzando il robot stereotassico, erogare 1 μl a 0,2 μl/min per valutare la tenuta del gradino del catetere durante la procedura di fissaggio. La soluzione di tripano blu deve essere visibile esclusivamente sulla punta del catetere. Puliscilo con un fazzoletto di carta.
- Posizionare il blocco di agarosio nel robot stereotassico e calibrare il robot in modo che la punta del catetere sia riferita alla superficie del blocco di agarosio.
- Programmare i parametri di iniezione per CED.
- Per il volume di iniezione di 5 μL, utilizzare i seguenti passaggi: 1 μL a 0,2 μL/min, quindi 2 μL a 0,5 μL/min e 2 μL a 0,8 μL/min. Regolare il volume di iniezione finale in base allo specifico piano sperimentale modificando proporzionalmente la durata di ciascuna delle fasi.
- Per iniettare la soluzione nel putamen caudato murino (striato), eseguire tale iniezione in una posizione di 1 mm frontale e 1,5-2 mm lateralmente dal bregma a una profondità di 3,5 mm.
- Dopo l'iniezione, lasciare il catetere in posizione per 2 minuti e poi ritrarlo a 1 mm/min per garantire una corretta dispersione del fluido nel cervello e sigillare il tratto di iniezione durante la rimozione del catetere.
nota: Tutti i parametri possono essere programmati in un unico script a seconda dello specifico robot stereotassico.
- Avviare la procedura CED e iniettare 5 μL di soluzione di blu di tripano nel blocco di agarosio.
- Valutare la forma di una nuvola di blu di tripano nell'agarosio e la potenziale fuoriuscita lungo il tratto del catetere. Il blu di tripano dovrebbe formare un ellissoide o una nuvola rotonda con il centro attorno alla punta del catetere e un diametro di almeno 1 mm. Non dovrebbe essere visibile alcun riflusso importante sulla punta dell'ago metallico.
- Posizionare un nuovo blocco di agarosio e iniziare una seconda iniezione di 1 μl a 0,2 μl/min per valutare l'ostruzione del catetere con l'agarosio. Il tripano blu dovrebbe ricominciare a formare una nuvola dalla punta del catetere subito dopo l'inizio dell'iniezione.
- Valutare se il volume residuo nella siringa corrisponde a 3 μL. Eventuali variazioni potrebbero indicare una perdita di liquido attraverso il supporto del catetere o lo stantuffo della siringa.
- Se tutte le iniezioni di prova hanno esito positivo, il catetere è ben sigillato e dritto e non si osserva alcuna soluzione di blu di tripano da punti diversi dalla punta del catetere, lavare il catetere con H2O deionizzato (dH2O) fino a quando non sono visibili tracce di blu di tripano e quindi lavare dieci volte come segue: etanolo al 70% ed etanolo al 100% seguiti da un nuovo lavaggio con etanolo al 70% e acqua deionizzata pulita.
- Conservare il catetere in condizioni asciutte.
2. Somministrazione potenziata dalla convezione della soluzione anticorpale nel cervello murino
NOTA: A seconda delle normative locali sul benessere degli animali, possono essere implementati vari tipi di anestetici, analgesici e antibiotici per questa procedura. Questo protocollo descrive l'uso dell'anestesia per iniezione. Gli anestetici per inalazione come l'isoflurano possono essere utilizzati anche montando una maschera nasale sul telaio stereotassico. Inoltre, si consiglia di aggiungere antibiotici all'acqua potabile per la profilassi delle infezioni.
- Configurazione chirurgica
- Preparare anestetici e soluzioni antidoto. I topi possono essere anestetizzati in sicurezza utilizzando un'anestesia a tre componenti contenente fentanil (0,05 mg/kg), midazolam (5 mg/kg) e medetomidina (0,5 mg/kg) diluiti in acqua distillata sterile (dH2O). Eseguiamo una procedura di risveglio in due fasi utilizzando due soluzioni antidoto, una contenente flumazenil (0,5 mg/kg) e buprenorfina (0,1 mg/kg) in dH2O sterile (prima soluzione antidoto). Il secondo contiene atipamezolo (2,5 mg/kg) in dH2O sterile (seconda soluzione di antidoto).
- Preparare una soluzione analgesica contenente carprofene (5,667 mg/kg) diluita con dH2O sterile.
- Pulisci il telaio stereotassico, il termoforo e gli elementi del robot stereotassico. Tenere presente che non tutte le parti del robot possono essere pulite senza rischio di danni. Fare riferimento al manuale del robot per i dettagli sulla pulizia e la preparazione per l'uso.
- Assemblare la siringa con il catetere a gradini e lavarla più volte con dH2O, etanolo al 70% ed etanolo al 100%, quindi risciacquare nuovamente con etanolo al 70% e dH2O. Infine, sciacquare la siringa con PBS o altri tamponi per preparare la soluzione per l'iniezione intracranica, ad es. liquido cerebrospinale artificiale. Lo stantuffo della siringa deve muoversi in modo fluido e libero durante la procedura.
- Calibrare il software del robot stereotassico con il frame stereotassico.
- Testare il software del robot stereotassico assicurandosi che i bracci del robot si muovano liberamente, che la pompa di iniezione sia collegata in modo appropriato e che possa eseguire la procedura CED senza disturbi. Ciò include il test del movimento del robot, l'iniezione in rampa, il controllo della fase di attesa di 2 minuti e il controllo della velocità di retrazione del catetere. Tutti i parametri devono corrispondere alla procedura CED preprogrammata descritta al punto 1.3.5.
- Inserire la punta del trapano nel trapano. Si consiglia di sterilizzare le punte del trapano prima dell'uso.
- Preparare la soluzione anticorpale utilizzando PBS o altre soluzioni tampone come il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF). In una singola procedura CED possono essere iniettati da 1 a 20 μg di anticorpi in 5 μl. Altri volumi e quantità di proteine devono essere testati prima di eseguire l'esperimento. Tenere presente che l'uso di soluzioni ad alta viscosità potrebbe portare all'intasamento del catetere.
- Caricare manualmente la siringa con l'anticorpo diluito.
- Iniezione di anticorpi mediante CED nello striato
- Pesare il topo e iniettare la soluzione anestetica a tre componenti nel peritoneo in base al peso corporeo. Prendere nota del tempo di iniezione. Trasferisci il mouse in una gabbia separata riscaldata con un termoforo.
- Osservare il mouse per determinare quando inizia la sedazione. Quando il topo smette di muoversi, applicare un unguento oftalmico sugli occhi per proteggere la cornea dall'essiccazione durante l'intervento chirurgico. La sedazione completa di solito inizia 10-15 minuti dopo l'iniezione della soluzione per anestesia a tre componenti.
- Controllare le reazioni al dolore utilizzando il test del riflesso di pizzico per garantire la completa anestesia dell'animale.
- Radere la testa usando un tagliacapelli.
- Disinfettare la pelle con tamponi di cotone imbevuti di soluzione di iodio. Strofinare la pelle tre volte con un movimento circolare.
- Praticare un'incisione cutanea di 10 mm lungo la linea mediana cranica, terminando all'altezza degli occhi utilizzando un bisturi.
- Fissare il mouse nel telaio stereotassico utilizzando il morsetto per il naso e le barre auricolari. Assicurarsi che la superficie del cranio sia orizzontale e ben fissata. Oltre alla corretta navigazione anatomica, è fondamentale anche evitare di inclinare il cranio durante la perforazione e la procedura CED.
- Posizionare la siringa nel robot stereotassico.
- Sincronizzare la punta del trapano con la punta del catetere su un punto di riferimento. La relazione tra la posizione del trapano e della siringa deve essere determinata con precisione nel software in modo che l'iniezione possa essere eseguita nella regione anatomica desiderata del cervello.
- Ritrarre la pelle usando una pinza e localizzare il bregma sulla superficie del cranio.
- Fare riferimento a Bregma nel software utilizzando la punta della punta del trapano.
- Spostare il trapano in una posizione di 1 mm frontale e 2 mm lateralmente rispetto alla bregma e praticare un foro di fresatura. Fare attenzione a non danneggiare la dura madre.
- Spostare la siringa sul foro della fresa.
- Erogare 0,5-1 μl dalla siringa per assicurarsi che non rimangano bolle d'aria nel catetere.
- Avviare il programma CED descritto al punto 1.3.5. Osservare la superficie del cranio per eventuali tracce di riflusso di liquido dal punto di iniezione. Monitorare la frequenza respiratoria dell'animale.
- Una volta terminato il programma CED e ritirato il catetere dal cervello, avviare la pompa di iniezione a 0,2 μL/min per verificare la presenza di ostruzioni del catetere durante la CED. Se non si è verificato alcun intasamento, dovresti vedere immediatamente una goccia di miscela per iniezione dalla punta del catetere.
- Prima di riutilizzare o conservare il catetere, esaminare visivamente il gradino del catetere al microscopio per verificare la presenza di eventuali segni di danneggiamento o usura e pulirlo come al punto 1.3.10.
