1. Coltura di cellule di microglia BV-2
NOTA: Maneggiare le cellule BV-2 in contenimento di Biosicurezza Livello 2. La linea cellulare BV-2 produce un retrovirus ecotropico ricombinante avvolto (in grado di infettare solo le cellule murine); Tali virus sono noti per la loro capacità di trasformazione in vitro e il potenziale tumorigenico in vivo.
- Coltura di cellule BV-2 in terreno di coltura Dulbecco modificato ad alto contenuto di glucosio (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 2 mM di L-glutammina (d'ora in poi indicata come terreno di coltura) seminando le cellule a 4 x 104 cellule/mL.
- Mantenere le colture in un'atmosfera umidificata del 5% di CO2 a 37 °C.
NOTA: le cellule crescono in modo lasco e in sospensione.
2. Etichetta gli aggregati tau ricombinanti con colorante fluorescente sensibile al pH
NOTA: Gli aggregati di tau sono stati preparati come descritto in Apetri et al.con la differenza che non è stata aggiunta tioflavina T (ThT) al tampone di reazione. I campioni aggregati sono stati raccolti in provette da centrifuga da 1,5 mL. Il segnale di fluorescenza finale è stato controllato mescolando 118 μL del campione del pool con 12 μL di una soluzione di ThT da 50 μM. Gli aggregati sono stati separati centrifugando la miscela di reazione di aggregazione a 20.000 x g per 1 ora a 4 °C. Il surnatante è stato analizzato da SEC-MALS per confermare che tutta la tau monomerica è stata convertita in aggregati. I pellet (aggregati tau) sono stati congelati e conservati in un congelatore a -80 °C.
- Risospendere gli aggregati tau in tampone bicarbonato di sodio 0,1 M (NaHCO3) a pH 8,5 ad una concentrazione di 1 mg/mL (~ 20 μM).
nota: La concentrazione di aggregati tau si basa sulla concentrazione iniziale di monomeri valutata dall'assorbimento di monomeri tau a 280 nm utilizzando un coefficiente di estinzione di 0,31 mLmg-1 cm-1 .
- Sonicare gli aggregati risospesi utilizzando un sonicatore a sonda mantenendoli sul ghiaccio per evitare il surriscaldamento.
- Utilizzare un'ampiezza del 65% (con un sonicatore di potenza 250 W).
- Eseguire 8 impulsi di 3 s con pause di 15 s tra gli impulsi per evitare il surriscaldamento.
- Preparare una soluzione madre da 8,9 mM di colorante sensibile al pH (d'ora in poi denominato colorante pH) in dimetilsolfossido (DMSO) seguendo le istruzioni del produttore.
nota: Prepara sempre una soluzione fresca e usala solo il giorno in cui viene preparata.
- Aggiungere 10 moli di colorante per mole di proteine fino a una concentrazione finale di colorante di 0,2 mM.
- Mescolare pipettando delicatamente su e giù.
- Incubare la miscela di reazione per 45-60 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
- Nel frattempo, assemblare una colonna di desalinizzazione in gel di destrano reticolato seguendo le istruzioni del produttore.
- Equilibrare la colonna con 25 mL di tampone 0,1 M NaHCO3 pH 8,5 contenente il 3% di DMSO. Scartare il flusso attraverso.
- Aggiungere il prodotto della reazione di marcatura dell'aggregato tau alla colonna in un volume totale di 2,5 mL. Se il campione è inferiore a 2,5 mL, aggiungere il tampone fino a raggiungere un volume totale di 2,5 mL.
- Lasciare che il campione entri completamente nel gel impacchettato, scartare il flusso.
- Eluire con 3,5 mL di tampone 0,1 M NaHCO3 pH 8,5 contenente il 3% di DMSO e raccogliere l'eluato in 4 frazioni equivalenti in provette da 2 mL.
- Determinare le concentrazioni proteiche delle 4 frazioni mediante il saggio dell'acido bicinconninico (BCA).
- Conservare le proteine etichettate in un congelatore a -20 °C.
3. Saggio di captazione con lettura FACS (Fluorescence-activated Cell Sorting)
- Giorno 1 – Semina le cellule
- Lavare le cellule BV-2 nel pallone rimuovendo il terreno di coltura e aggiungendo 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
nota: Il volume di lavaggio varierà in base alle dimensioni del pallone a celle utilizzato. Ad esempio, per un matraccio T175, lavare con 10 ml di 1x PBS.
- Rimuovere il PBS dal matraccio e staccare le cellule incubandole con acido tripsin-etilendiamminotetraacetico (EDTA) 0,05% a 37 °C e CO2 al 5% fino a quando le cellule non si staccano dal matraccio (circa 5 minuti).
nota: Il volume di tripsina-EDTA 0,05% dipende dalle dimensioni del pallone cellulare. Ad esempio, per un matraccio T175, utilizzare 2 mL di tripsina-EDTA 0,05%.
- Risospendere le cellule nel terreno di coltura pipettando su e giù da tre a cinque volte.
NOTA: Il volume del terreno di coltura varia in base alle dimensioni del pallone utilizzato e quindi al numero totale di cellule nel pallone. Ad esempio, per un matraccio T175, utilizzare 8 ml di terreno di coltura.
- Contare le cellule e creare una sospensione cellulare con una concentrazione finale di 1 x 105 cellule/mL in un terreno di coltura contenente 200 μg/mL di eparina.
- Piastra 250 μl di sospensione cellulare (2,5 x 104 cellule) per pozzetto in una piastra a fondo piatto per coltura tissutale a 96 pozzetti.
- Incubare la piastra per una notte a 37 °C e 5% di CO2.
- Giorno 1 – Preparare gli immunocomplessi
- Scongelare il colorante pH tau sul ghiaccio.
- Preparare 65 μl per condizione di una soluzione da 500 nM di aggregati di colorante-tau a pH in terreno privo di siero (SFM) (DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 200 μg/mL di eparina).
- Preparare le diluizioni degli anticorpi in 65 μl di SFM ad una concentrazione doppia rispetto al finale. Miscelare gli aggregati di coloranti tau e gli anticorpi a pH in una piastra con fondo a U a 96 pozzetti. Il volume finale per condizione è ora di 130 μl e la concentrazione di aggregati colorante-tau a pH è di 250 nM. Sigillare la piastra di diluizione e incubare per una notte a 37 °C.
- Giorno 2 – Assorbimento degli immunocomplessi
- Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule BV-2. Lavare le celle una volta con 100 μL di temperatura ambiente 1x PBS.
- Trasferire 125 μL di immunocomplessi alle cellule utilizzando una pipetta multicanale. Incubare le cellule con gli immunocomplessi per 2 ore a 37 °C e 5% di CO2.
- Rimuovere il mezzo di incubazione dalle cellule e gettarlo. Lavare le celle una volta con 100 μL di temperatura ambiente 1x PBS.
- Rimuovere 1x PBS e trattare le cellule con 50 μL di tripsina-EDTA 0,25% per 20 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
- Aggiungere 200 μl di terreno di coltura e risospendere bene pipettando su e giù per staccare le cellule. Trasferire le cellule su una piastra con fondo a U a 96 pozzetti. Centrifugare la piastra a 400 x g per 5 min a 4 °C.
- Mettere la piastra sul ghiaccio, rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule due volte risospendendo i pellet di cellule in 150 μL di 1x PBS ghiacciato. Centrifugare la piastra a 400 x g per 5 min a 4 °C.
- Mettere le cellule sul ghiaccio, rimuovere 1x PBS aggiunto e lavarle risospendendo i pellet cellulari in 150 μL di tampone FACS freddo (1x PBS, 0,5% albumina sierica bovina (BSA), 2 mM EDTA). Centrifugare la piastra a 400 x g per 5 min a 4 °C.
- Mettere le cellule sul ghiaccio, rimuovere il tampone FACS aggiunto e risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS freddo.
- Analizzare immediatamente i campioni mediante FACS, acquisendo 2 x 104 eventi nel gate delle celle vive (vedere il passaggio 4.1).
