1. Purificazione degli anticorpi
NOTA: Il tampone di equilibrio per l'anticorpo interno è 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5. Il tampone di eluizione utilizzato è l'acido acetico 0,1 M. I tamponi e la resina (proteina A) dipendono dall'anticorpo specifico purificato. Il volume della colonna è equivalente all'altezza del letto della resina. La quantità di fase mobile utilizzata è determinata in termini di volume della colonna.
- Inizializzazione del sistema di depurazione
- Aprire il software collegato al sistema di purificazione. Utilizzando le istruzioni manuali, equilibrare la colonna con il tampone di equilibratura a una velocità di flusso di 2 mL/min per 40 min. Arrestare la corsa manuale dopo l'equilibratura.
- Nel collettore delle frazioni, posizionare provette coniche da 15 mL per raccogliere l'eluato di anticorpi purificato e provette coniche da 50 mL per raccogliere il flusso durante il lavaggio ad alto contenuto di sale. Assicurarsi che il raccoglitore di frazioni sia riportato alla posizione iniziale aprendo e chiudendo il raccoglitore di frazioni prima dell'inizio della seduta. Il collettore di frazioni viene mantenuto a 7 °C.
nota: Il raccoglitore di frazioni può essere ripristinato manualmente nella scheda Collettore di frazioni in Impostazioni, sia per le provette da 15 ml che per quelle da 50 ml.
- Iniezione di campioni
nota: Il fluido di coltura cellulare raccolto utilizzato nelle seguenti procedure è stato ottenuto da cellule ovariche di criceto cinese coltivate in micro-bioreattori automatizzati.
- Aggiungere il liquido filtrato per colture cellulari da 0,22 μm a una siringa vuota da 12 mL con l'estremità dell'ugello tappata.
- Tenendo la siringa con l'ugello rivolto verso il basso, inserire lo stantuffo della siringa fino a quando una piccola parte dello stantuffo non è inserita. Assicurandosi che il liquido non fuoriesca, girare la siringa con l'ugello rivolto verso l'alto e rimuovere il tappo.
- Tenendo ancora la siringa con l'ugello rivolto verso l'alto, spingere il cilindro per espellere l'aria fino a quando il fluido di coltura cellulare non si trova sulla punta dell'ugello. Inserire l'ugello della siringa nella porta di iniezione manuale sul sistema di purificazione e ruotare per serrare.
- Spingere verso il basso lo stantuffo fino a quando tutto il campione non viene iniettato ed è visibile nell'ansa di campione di grande volume da 10 mL collegata.
- Apri il file del metodo salvato. Salvare il file dei risultati nel percorso richiesto e specificare il nome del file quando richiesto. Hit run dopo che il campione è stato iniettato nel ciclo di campionamento di grandi volumi.
- Esecuzione del metodo di purificazione
- Selezionare il metodo salvato e fare clic su Esegui quando richiesto dal software dello strumento (passaggio 1.2.5).
nota: Il sistema è configurato per eseguire i passaggi seguenti. L'utente non deve fare nulla mentre lo strumento è in funzione.
- Equilibrare la colonna con tre volumi di colonna (CV) di tampone di equilibrio a una velocità di flusso di 2 mL/min. Una volta che la colonna è stata bilanciata, il sistema, utilizzando il circuito di campionamento di grande volume, inietterà il campione sulla colonna a una velocità di flusso di 1 mL/min.
- Un calo del segnale UV a 280 nm indica che il campione ha terminato il caricamento. Lavare la colonna con tampone di equilibrazione a una velocità di flusso di 2 mL/min fino a quando il segnale UV non scende al di sotto di 25 mAU.
- Utilizzare quattro CV di Tris da 25 mM con 1 M di NaCl a pH 7,5 per eseguire un lavaggio secondario ad alto contenuto di sale a una velocità di flusso di 2 mL/min. Il collettore di frazioni del sistema raccoglierà tutte le proteine/DNA che fuoriescono dalla colonna durante il lavaggio con sale in provette da 50 mL.
- Applicare cinque CV di tampone di eluizione a una velocità di flusso di 1 mL/min per eluire l'anticorpo dalla colonna. Raccogliere l'eluato in provette da 15 mL in base al segnale UV; quando il segnale UV 280 è superiore a 35 mAU, inizia la raccolta; la raccolta termina quando il segnale scende al di sotto di 50 mAU; Questo è chiamato taglio di picco.
nota: Il taglio dei picchi garantisce la normalizzazione dei profili di eluizione e per evitare la coda dei picchi di eluizione, che possono contenere aggregati proteici.
- Lavare la colonna utilizzando tre CV di tampone di equilibratura. La corsa termina dopo la fase di lavaggio.
- Dopo l'eluizione, neutralizzare immediatamente la proteina purificata utilizzando 1 M di base Tris a un pH di ~5,5. Misurare la concentrazione di proteine utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a microvolume a 280 nm e 260 nm e conservarla a 4 °C.
