Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
PARTE 1: Istituzione di colture neuronali ippocampali dissociate, fetali, roditrici
1. Passaggi preparatori
- Rivestimento in poli-L-lisina (PLL) delle superfici di placcatura (3 giorni prima della dissezione)
- Preparare il tampone borato aggiungendo 2,38 g di acido borico e 1,27 g di borace a 500 ml di acqua distillata e mescolando per 15 minuti fino a quando non si sarà sciolto. Sotto una cappa, sterilizzare la soluzione tampone filtrandola (dimensione dei pori di 0,2 μm), etichettarla e conservarla a temperatura ambiente (RT).
nota: Questa soluzione è stabile e può essere utilizzata per 6 mesi.
ATTENZIONE: Quando si prepara il tampone borato, indossare i dispositivi di protezione individuale consigliati.
- Preparare la soluzione madre PLL (100 mg/mL) aggiungendo 1 g di PLL a 10 mL di acqua distillata e agitando fino a quando non si sarà sciolta. Preparare 500 μL di aliquote di soluzione madre PLL. Per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg/mL, aggiungere 500 μL di aliquota PLL a 50 mL di tampone borato e agitare fino a dissoluzione e sterilizzare la soluzione filtrando (dimensione dei pori di 0,2 μm).
nota: Questa soluzione è stabile e può essere utilizzata per 6 mesi.
- Preparare le superfici per il rivestimento. Utilizzare vetrini coprioggetti di 12 mm di diametro per le procedure di immunocolorazione e piastre con fondo di vetro per studi che includeranno l'imaging di neuroni vivi. Se si utilizzano vetrini coprioggetti, sterilizzare in autoclave e poi posizionare cinque vetrini coprioggetti in ogni piatto (3,5 cm di diametro).
nota: Lo spessore del vetrino coprioggetti influisce sulla qualità e sull'intensità del segnale delle immagini acquisite. La maggior parte degli obiettivi del microscopio sono progettati per vetrini coprioggetti #1.5. Scegliere i vetrini coprioggetti appropriati in base alla configurazione e alle tecniche di imaging.
- Sotto una cappa, aggiungere 1,5 ml di soluzione PLL a ciascuna piastra (piastra con fondo di vetro o piastra da 3,5 cm con cinque vetrini). Assicurati che tutti i vetrini coprioggetti siano sommersi e conservati a RT per 24 ore.
- 2 giorni prima della dissezione, aspirare la soluzione PLL e lavare con acqua sterile priva di endotossine, assicurandosi che i vetrini coprioggetti siano sommersi. Conservare l'acqua nelle stoviglie e conservarla a RT per 24 ore.
- 1 giorno prima della dissezione, aspirare l'acqua e sostituirla con terreni di coltura NB + B27 (vedi sotto), quindi porre le piastre in un'incubatrice a 37 °C per 24 ore.
- Preparazione dei terreni di coltura e della soluzione madre (1 giorno prima della dissezione)
- Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): a 500 ml di DMEM ad alto contenuto di glucosio (4,5 g/L) senza L-glutammina e rosso fenolo, aggiungere 50 ml di siero di cavallo, 50 ml di siero fetale bovino (FBS), 10 ml di L-glutammina (200 mM), 10 ml di piruvato di sodio (100 mM), 10 ml di penicillina-streptomicina (10.000 U/mL). Filtrare (dimensione dei pori di 0,2 μm) e conservare in aliquote da 5 mL a 4 oC con tappo ben chiuso.
nota: Questa soluzione è stabile e può essere utilizzata per 1 mese.
- Terreno neurobasale (NB) integrato con B27 (NB + B27): a 50 ml di terreno NB senza rosso fenolo, aggiungere 1 ml di integratore di B27.
- Hibernate-E medium addizionato con B27 (Hibernate + B27): a 50 mL di Hibernate-E medium, aggiungere 1 mL di integratore di B27.
- Soluzione fisiologica extracellulare (EPS): a 1 L di acqua sterile, aggiungere quanto segue alle concentrazioni finali specificate: NaCl (140 mM), KCl (3,5 mM), N-(2-idrossietil)piperazina-N'-(acido 2-etansolfonico) (HEPES, 10 mM), glucosio (20 mM) e CaCl2 (2 mM). Mescolare fino a quando non si scioglie e regolare il pH a 7,4 aggiungendo NaOH (0,5 M) o HCl (0,5 M). Sotto la cappa, sterilizzare filtrando (dimensione dei pori di 0,2 μm) e conservare a 4°C.
- Attrezzature e altro materiale di laboratorio (giorno della dissezione)
- Impostare un bagnomaria a 37 °C. Riscaldare le seguenti aliquote: 50 ml di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) e 5 ml di DMEM.
- Sterilizzare i seguenti strumenti immergendoli in un becher contenente etanolo assoluto (Figura 1B): pinze, pinze curve, forbici, pinze a curva fine, pinze dritte fine, forbici chirurgiche, pinze ad angolo fine e forbici a molla di precisione.
nota: Per proteggere gli utensili, posizionare un materiale morbido (ad es. salviette di precisione scientifiche) nella parte inferiore del becher.
- Riempi due vaschette di ghiaccio e posiziona i seguenti oggetti.
- Vaschetta del ghiaccio 1 (Figura 1C): Posizionare gli strumenti chirurgici nel becher con etanolo assoluto, un becher con HBSS per il risciacquo degli strumenti chirurgici, una piastra da 10 cm con HBSS per posizionare gli embrioni, una piastra da 6 cm con HBSS per posizionare le teste degli embrioni e una piastra da 6 cm con Hibernate + B27 per posizionare il cervello degli embrioni.
- Vaschetta del ghiaccio 2: Posizionare un'aliquota da 1 ml di tripsina 2,5% e un piatto da 3,5 cm con Hibernate + B27 per l'ippocampo sezionato.
nota: Il tempo necessario per questa procedura dipende dall'esperienza dello sperimentatore e dal numero di embrioni da sezionare. Pertanto, il ghiaccio deve rimanere congelato per il tempo necessario. A questo scopo si consigliano vassoi in polistirolo.
2. Dissezione e semina (Figura 1)
- Isolamento ippocampale
nota: I ratti gravidi con embrioni al giorno embrionale 18 (E18) vengono soppressi immediatamente prima dell'inizio del protocollo in conformità con il comitato etico locale dell'Università di Barcellona, seguendo le normative europee (2010/63/UE) sull'uso e la cura degli animali da esperimento. In questo protocollo, l'inalazione di anidride carbonica (CO2) è stata utilizzata come metodo di eutanasia.
- Sezionare il ratto a livello del peritoneo addominale usando una pinza e delle forbici. Estrarre l'utero con gli embrioni E18 e metterlo in una pirofila di 10 cm che è stata raffreddata con ghiaccio.
NOTA: È importante evitare che i peli di ratto si attacchino agli embrioni. Si consiglia di utilizzare abbondanti quantità di etanolo al 70% per sterilizzare l'addome. Da questo passaggio in poi, lavorare all'interno della cappa sulla vaschetta del ghiaccio 1.
- Aprire le sacche embrionali e trasferire gli embrioni nella piastra da 10 cm con HBSS, assicurandosi che gli embrioni siano completamente immersi.
- Rimuovere la testa dell'embrione con le forbici e posizionarla nel piatto da 6 cm con HBSS. Ripeti questo processo con tutti gli embrioni.
nota: Per evitare la contaminazione, tutto il tessuto, ad eccezione delle teste embrionali, deve essere scartato in un contenitore con tappo a vite.
- Tenere la testa dell'embrione con una pinza a curvatura fine e perforare le orbite con un paio di pinze dritte, entrando con un angolo di 45°, quindi rilasciare la pinza a curvatura fine.
nota: Il forcipe non deve passare attraverso il cervello, quindi è importante mantenere l'angolo quando si entra.
- Sezionare la pelle e il cranio con le forbici chirurgiche, partendo dall'osso occipitale fino all'osso frontale. Rimuovere il cervello con un paio di pinze a forma di pinze a curvatura fine e posizionarlo nel piatto da 6 cm con Hibernate + B27. Ripeti questo processo fino a quando tutti i cervelli non sono recuperati.
- Separare sagittalmente i telencefali con la pinza fine-diritta.
nota: Da questo passaggio in poi, la dissezione dell'ippocampo viene eseguita sotto uno stereomicroscopio. Si consiglia di utilizzare lampade snodate in modo che la luce illumini la superficie di dissezione dai lati. Si consiglia inoltre di utilizzare uno sfondo nero in quanto ciò fornisce un maggiore contrasto, consentendo di distinguere meglio l'ippocampo.
- Preparare un piatto di 10 cm posizionando gocce di Hibernate + B27 a distanze di 1 cm (ad esempio, in cerchio). Posizionare un telencefalo per goccia di Hibernate + B27 e visualizzare attraverso il cannocchiale da dissezione (si consiglia un ingrandimento dell'obiettivo 1,25x).
- Sbucciare con cura le meningi e rimuovere il talamo per visualizzare meglio l'ippocampo.
- Sezionare l'ippocampo con le forbici a molla di precisione e posizionarlo nel piatto da 3,5 cm con Hibernate + B27 nella vaschetta del ghiaccio 2. Ripeti per ogni telencefalo fino a quando tutti gli ippocampi sono raccolti.
- Raccogli con cura tutti gli ippocampi con una pipetta Pasteur e trasferiscili in una provetta da 50 ml.
nota: Prelevare il volume minimo di Hibernate + B27 quando si raccoglie l'ippocampo in modo da non diluire la tripsina.
- Dissociazione cellulare
- Dissociazione enzimatica dell'ippocampo
- Nella provetta da 50 mL contenente l'ippocampo, aggiungere 1 mL di tripsina al 2,5% e portarlo a un volume di 5 mL con HBSS. Incubare per 15 minuti a bagnomaria a 37 °C.
- Per diluire la tripsina, aggiungere 10 mL di HBSS preriscaldato e incubare per 5 minuti a bagnomaria a 37 °C.
- Trasferire gli ippocampi che ora appaiono come una massa di muco in una provetta da 50 ml con una micropipetta da 1.000 μl, aggiungere 6 ml di HBSS preriscaldato e incubare per 5 minuti a bagnomaria a 37 °C.
- Dissociazione meccanica dell'ippocampo
- Trasferire la massa in una provetta da 2 mL a fondo conico, prelevando il volume minimo. Aggiungere 1 mL di terreno DMEM preriscaldato. Omogeneizzare il pellet con una micropipetta da 1.000 μl aspirando delicatamente su e giù.
nota: È fondamentale evitare di generare bolle durante l'aspirazione, poiché le bolle possono lisare le cellule.
- Ripetere l'aspirazione su e giù con una pipetta di vetro pre-estratta (10x-20x), con la punta a contatto con il fondo conico del tubo. Evita di generare bolle. Al termine di questa fase, la miscela deve essere traslucida.
- Una volta miscelata in modo omogeneo in modo che la miscela sia traslucida, trasferire la miscela in una provetta contenente 4 mL di terreno DMEM a 37 °C e omogeneizzare con una pipetta di vetro pipettando su e giù.
- Semina cellulare
- Conta le celle. Il numero di neuroni nella soluzione può essere contato secondo le procedure standard di laboratorio.
nota: Negli esperimenti di imaging per la rilevazione degli anticorpi e l'attività del calcio, una concentrazione di 50.000 cellule per piatto da 3,5 cm è ottimale.
- Mantenendo le celle sospese, prelevare il volume calcolato e impiattare in piastre da 3,5 cm contenenti vetrini coprioggetti rivestiti di PLL o nelle piastre con fondo di vetro rivestite di PLL.
- Distribuire uniformemente le cellule sulle piastre agitando delicatamente con movimenti incrociati (avanti e indietro, poi da un lato all'altro; ripetere se necessario) e posizionare le piastre nell'incubatore di CO2 (5><%).
nota: È importante utilizzare movimenti incrociati per evitare che le cellule si depositino nella periferia del piatto.
- Ogni settimana, aggiungere circa 1 ml di NB + B27, in modo che la coltura non si asciughi.
nota: Dopo 2 settimane (14 giorni in vitro [div]), i neuroni sono maturi ed esprimono tutti i fattori da utilizzare per la sperimentazione. Il numero medio totale di neuroni ottenuti utilizzando questo protocollo è di circa 2,5 x 106 neuroni provenienti da una media di 12 embrioni E18 per ratto gravido.
PARTE 2: Utilizzo di colture neuronali ippocampali per il rilevamento di anticorpi nelle proteine della superficie delle cellule neuronali
NOTA: Questa parte del protocollo dimostra come le colture ippocampali vengono utilizzate per identificare gli anticorpi anti-NMDAR nel siero e/o nel liquido cerebrospinale dei pazienti con encefalite anti-NMDAR. L'immunocolorazione fluorescente viene utilizzata per visualizzare la reattività nei neuroni vivi, ma potrebbero essere utilizzati anche altri metodi di visualizzazione. Un controllo appropriato per questo esperimento sarebbe il siero o il liquido cerebrospinale di un individuo sano. Quando si utilizzano campioni umani, tenere presente che potrebbe essere necessaria l'approvazione del comitato etico istituzionale.
3. Immunocolorazione fluorescente dal vivo
- Utilizzare 14 cellule div che sono state coltivate su vetrini coprioggetti (50.000 cellule per piatto da 3,5 cm contenente cinque vetrini coprioggetti).
- All'interno del cappuccio, sciacquare i vetrini coprioggetti con NB preriscaldato a 37 °C.
- Aggiungere il campione che in questo caso contiene anticorpi anti-NMDAR (utilizzati come anticorpi primari) diluiti in terreno NB a 1:200 per il siero o 1:2 per il liquido cerebrospinale e incubare 1 ora a 37 °C (all'interno dell'incubatore di CO2 (5%).
- Risciacquare accuratamente con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 3 volte a RT.
- Aggiungere la soluzione di fissazione (formaldeide al 4% in PBS) e incubare a RT per 5 min.
cautela: Quando si maneggia il 4% di formaldeide, lavorare all'interno della cappa e indossare i dispositivi di protezione individuale consigliati.
- Lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
- Aggiungere l'anticorpo secondario Goat anti-Human AF488 alla diluizione di 1:1000 e incubare a RT per 1 h.
nota: Durante l'incubazione, proteggere dall'esposizione alla luce coprendo con un foglio di alluminio.
- Lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuno. Risciacquare con acqua distillata
- Montare i vetrini coprioggetti con un mezzo di montaggio liquido (ad es. mezzi di montaggio antisbiadimento con DAPI; circa 7 μL), aspirare il liquido rimanente e risciacquare con acqua distillata. I neuroni sono ora pronti per l'imaging a fluorescenza.
cautela: Quando si maneggia il mezzo di montaggio, indossare i dispositivi di protezione individuale consigliati.
