Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti in una cappa BSL2 se non diversamente specificato. La titolazione virale è necessaria prima di un test di neutralizzazione della riduzione della placca (PRN) per determinare la concentrazione ottimale di RSV utilizzata nel test PRN. Si raccomanda di aliquotare le scorte di virus in un piccolo volume che verrà scongelato una volta e utilizzato per ogni test di NAb. Si raccomanda inoltre di utilizzare lo stesso stock virale per tutti i dosaggi di NAb eseguiti per tutti i campioni di uno studio. Assicurarsi che i terreni di coltura e la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) siano riscaldati a 37 °C prima di aggiungerli alle piastre cellulari.
1. Titolazione virale dell'RSV
NOTA: A seconda del numero di scorte di virus e del numero di duplicati, la piastra del test può essere impostata secondo la Figura 1. Ogni stock virale deve essere titolato in triplicato lungo la piastra del test, a partire dalla concentrazione virale più alta (cioè 1:10). Le titolazioni seriali possono essere in genere 1:10. Le procedure di coltura e mantenimento cellulare A549 e di coltura di RSV vengono eseguite utilizzando procedure standard e non sono incluse in questo protocollo.
- Piastre di semina (Giorno 1)
- Risospendere le cellule A549 nel terreno Modified Eagles (DMEM) di Dulbecco + 10% di siero fetale di vitello (FCS) + 1000 UI di penicillina/streptomicina (penna/streptococco) a 4 x 105/mL. Piastre sterili a fondo piatto a 96 pozzetti con 100 μL/pozzetto contenenti 4 x 104 celle A459.
- Incubare le piastre per una notte a 37 °C, 5% di anidride carbonica (CO2) (le cellule saranno in fase di crescita logaritmica).
nota: Utilizzare una nuova fiala di cellule A549 dopo 23 passaggi. Si raccomanda di non iniziare gli esperimenti quando una nuova fiala di cellule è ancora nei primi tre passaggi.
- Infezione da virus (Giorno 2)
- Preparazione della diluizione seriale del virus
- Scongelare rapidamente una singola fiala congelata di virus respiratorio sinciziale (RSV) in un bagno d'acqua a 37 °C fino a scongelamento quasi completo e metterla immediatamente in ghiaccio. Preparare 3 repliche per ogni stock di virus RSV da analizzare, utilizzare una diluizione iniziale del virus stock di 1:10 con 100 μL di virus/pozzetto diluito e riservare almeno una colonna per il controllo negativo.
NOTA: La Figura 1 mostra il controllo negativo in triplicati.
- Aggiungere 100 μl di ciascun virus diluito a 1:10 in triplicato della riga A di una piastra sterile con fondo a U a 96 pozzetti. Aggiungere 90 μL/pozzetto di DMEM + 1000 UI di pen/strep senza FCS alle righe da B a H.
- Eseguire diluizioni seriali 1:10 lungo la piastra trasferendo 10 μl dalla fila A alla riga B. Miscelare la soluzione pipettando il contenuto su e giù 5 volte e continuare le diluizioni di dieci volte fino alla riga H. Scartare gli ultimi 10 μl in modo che il volume finale in ciascun pozzetto sia di 90 μl.
NOTA: È importante utilizzare nuovi puntali per ogni diluizione.
- Inoculazione del virus in cellule A549
- Recupera le piastre cellulari A549 preparate il giorno precedente. Assicurarsi che i monostrati di celle A549 nelle piastre a 96 pozzetti siano confluenti al ~80%. Scartare il supporto capovolgendo delicatamente la lastra e tamponandola leggermente su un tovagliolo di carta assorbente sterile.
- Lavare due volte tutti i pozzetti con 100 μL di PBS; scartare l'eccesso di PBS capovolgendo delicatamente la piastra e tamponando leggermente su un tovagliolo di carta assorbente sterile dopo ogni lavaggio. Non lasciare asciugare le piastre.
- Trasferire le diluizioni del virus dalla piastra di titolazione virale (Figura 1) ai pozzetti corrispondenti sulla piastra cellulare A549. Incubare la piastra per 1 ora a 37 °C, 5% CO2. Dopo 1 ora di incubazione, decantare i surnatanti utilizzando una pipetta (per evitare la contaminazione incrociata). Estrarre 90 μL/pozzetto.
- Aggiungere 100 μl di 1x medium 199 (M199, vedere la Tabella dei materiali) + 1,5% di sale sodico di carbossimetilcellulosa (CMC) a bassa viscosità + 2% di FCS contenente penna/strep a ciascun pozzetto.
NOTA: 2x M199 + 4% FCS + 2% pen/strep e 3% CMC soluzioni devono essere preparate e conservate a 4 °C per un uso futuro. Assicurarsi che la soluzione sia riscaldata a 37 °C prima di aggiungerla alle piastre.
- Preparare 2 soluzioni M199: 1 bustina/500 ml di acqua distillata + 20 ml di FCS + 10 ml di penna/streptococco (per ottenere 2 mi99). Filtrare la soluzione utilizzando un'unità filtrante da 0,22 μm.
- Per la preparazione di CMC al 3%, aggiungere lentamente 15 g di CMC in 500 ml di acqua distillata. Sciogliere la CMC in acqua utilizzando un agitatore metallico a 50 °C, che richiede circa 1 ora per la preparazione. Mescolare bene per ottenere il 3% di CMC e sterilizzare in autoclave la soluzione.
NOTA: Il solido CMC deve essere aggiunto all'acqua da sciogliere; L'aggiunta di acqua al solido secco produce un "grumo" di solido molto difficile da sciogliere.
- Preparare 1x M199 + 1,5% CMC a bassa viscosità + 2% FCS contenente penna/streptococco mescolando 1:1, 2x M199 e 3% CMC preparati al punto 1.2.2.4.2.
- Incubare la piastra per 3 giorni a 37 °C, 5% CO2.
- Sviluppo della piastra di analisi e del saggio (Giorno 5)
- Piastra di determinazione e sviluppo
- Eliminare M199 + CMC + 2% FCS contenente penna/strep capovolgendo delicatamente la piastra. Aggiungere lentamente (per evitare di disturbare lo strato cellulare) 200 μl di tampone di fissazione (80% acetone, 20% PBS, conservato a -20 °C) per fissare le cellule. Incubare a -20 °C per 20 min.
- Gettare il tampone di fissaggio e tamponarlo delicatamente su un tovagliolo di carta assorbente. Lasciare asciugare la piastra a faccia in giù per 10 minuti.
nota: Da questa fase in poi, il test può essere eseguito al di fuori della cappa BSL2.
- Preparare una soluzione bloccante del diluente del latte al 5% in PBS filtrato contenente lo 0,05% di polisorbato 20 (polisorbato PBS, vedere la Tabella dei materiali). Calcolare il volume necessario per il blocco di una piastra in base a 200 /pozzetti e 110 pozzetti: 200 μL/pozzetto x 110 pozzetti = 22 mL (1,1 mL di diluente di latte concentrato in 20,9 mL di PBS-polisorbato filtrato). In questa fase, preparare anche una soluzione bloccante sufficiente per gli anticorpi primari e secondari. Calcolare il volume necessario per ciascuna soluzione di anticorpo per una piastra in base a 50 μL/pozzetto e 110 pozzetti: 50 μL/pozzetto x 110 pozzetti = 5,5 mL. Pertanto, il volume totale di soluzione bloccante del diluente del latte richiesto per un saggio su singola piastra è di 33 mL.
- Aggiungere 200 μL/pozzetto di soluzione bloccante. Incubare la piastra a temperatura ambiente (RT) per 30 min. Eliminare la soluzione capovolgendo delicatamente la piastra e tamponare su un tovagliolo di carta assorbente.
- Preparare l'anticorpo 1:500 Goat X RSV (mAb – anticorpo primario) diluito in soluzione bloccante. Aggiungere 50 μL/pozzetto della soluzione di mAb e incubare a 37 °C per 1 ora. Lavare la piastra 3 volte con polisorbato PBS filtrato.
- Preparare 1:5.000 Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (anticorpo secondario) diluito in soluzione bloccante. Aggiungere 50 μL/pozzetto della soluzione di anticorpi secondari e incubare a 37 °C per 1 ora. Lavare la piastra 5 volte con polisorbato PBS filtrato.
- Leggere la piastra su un lettore di punti automatico utilizzando il canale dell'isotiocianato di fluoresceina (FITC) e le impostazioni di conteggio, come mostrato nella Figura 2. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e conservarla a 4 °C. Tarare lo strumento utilizzando una piastra di coltura a 96 pozzetti inutilizzata e inserendo le impostazioni di conteggio prima del saggio.
nota: Se necessario, è possibile ripetere la scansione entro pochi giorni. L'impostazione della calibrazione e del conteggio può essere salvata e utilizzata per scansioni future se il test utilizza lo stesso tipo di piastra utilizzata per la calibrazione.
- Controllare le immagini dei pozzetti per verificare la presenza di placche artefatti o monostrati cellulari interrotti (Figura 3). Escludere i pozzetti con monostrati cellulari interrotti.
nota: A seconda delle dimensioni delle placche degli artefatti, potrebbe essere necessario eseguire conteggi manuali per quei pozzetti, oppure potrebbe essere necessario scartare tali pozzetti dall'analisi dei dati. I criteri per un risultato valido includono l'assenza di placche di monostrato cellulare o artefatti interrotte rilevate in più di un pozzetto replicato e l'assenza di unità formanti placche (PFU) rilevate in pozzetti negativi (pozzetti senza aggiunta di virus).
- Determinare le concentrazioni virali
- Scegliere le ultime due diluizioni in cui le macchie possono essere contate chiaramente. Calcolare il numero medio di spot da pozzetti replicati alla stessa diluizione. Calcolare il titolo virale (PFU per ml) del campione stock utilizzando la formula seguente:
PFU/mL = Numero medio di placche/(Fattore di diluizione × Volume del virus diluito aggiunto al pozzetto)
nota: La concentrazione virale determinata per ciascun stock di RSV può ora essere utilizzata nel test PRN (fase 2).
2. Saggio di neutralizzazione RSV
- Piastre di semina (Giorno 1)
- Risospendere le cellule A549 in DMEM + 10% FCS + 1000 UI pen/strep a 4 x 105/mL. Seminare piastre sterili a fondo piatto a 96 pozzetti con 100 μL/pozzetto contenenti 4 x 104 cellule A459 e incubare le piastre per una notte a 37 °C, 5% di CO2 (le cellule saranno in fase di crescita logaritmica).
nota: Utilizzare una nuova fiala di cellule A549 dopo 23 passaggi. Si sconsiglia l'uso di celle A549 prima del passaggio numero 3.
- Preparazione del virus e del siero (Giorno 2)
nota: A seconda del tipo di campione, sono necessari passaggi per la pre-elaborazione dei campioni prima del test NAb. Si consiglia di utilizzare i sieri standard internazionali RSV, ora disponibili su richiesta presso il National Institute for Biological Standards and Controls (NIBSC).
- Preparazione della diluizione del siero
- Scongelare l'antisiero di riferimento per l'RSV umano (siero di riferimento, REF) e i campioni di siero al test RT. Inattivare termicamente i campioni di siero e l'antisiero di riferimento a bagnomaria a 56 °C per 30 minuti prima dell'uso. Preparare le diluizioni secondo il modello di piastra (Figura 4).
- Preparare una diluizione 1:100 del REF. Preparare un minimo di 110 μl di REF diluito in DMEM + penna/strep senza FCS per piastra di saggio (ad esempio, 1,5 μl di REF in un volume totale di 150 μl). Aggiungere 110 μl di REF diluito 1:100 nel pozzetto A12 di una piastra sterile con fondo a U a 96 pozzetti.
- Aggiungere 55 μL di DMEM + pen/strep senza FCS ai pozzetti da B12 a H12 nella colonna 12. Eseguire diluizioni seriali 1:2 lungo la piastra trasferendo 55 μl dalla fila A alla riga B, miscelando la soluzione pipettando il contenuto su e giù 5 volte e continuando fino alla riga H. Scartare gli ultimi 55 μl di terreno in modo che il volume finale in ciascun pozzetto sia di 55 μl. Utilizzare nuovi puntali per ogni diluizione.
- Preparare la diluizione 1:100 dei campioni di siero. Poiché tutti i campioni di siero sono analizzati in triplicato, preparare un volume minimo di 110 μl/pozzetto x 3 = 330 μl per campione di siero.
- Aggiungere 110 μl di ciascun campione di siero diluito (1:100; S1 = siero 1, S2 = siero 2, ecc.) ai corrispondenti pozzetti da A1 ad A9 e anche da E1 a E9 della piastra sterile a 96 pozzetti secondo la Figura 4.
- Aggiungere 55 μL di DMEM + penna/strep senza FCS a tutti i pozzetti etichettati X. Eseguire diluizioni seriali 1:2 come indicato al passaggio 2.2.1.3 fino alla riga D (per i campioni 1, 2 e 3). Scartare gli ultimi 55 μl di terreno in modo che il volume finale in ciascun pozzetto sia di 55 μl. Allo stesso modo, eseguire le diluizioni seriali 1:2 per i campioni 4, 5 e 6 per le righe da E a H.
nota: È essenziale utilizzare nuove punte per ogni diluizione.
- Aggiungere 55 μL di DMEM + penna/strep senza FCS ai pozzetti nelle colonne 10 e 11.
- Preparazione del virus
- Scongelare rapidamente una singola fiala congelata di RSV a bagnomaria a 37 °C fino a scongelamento quasi completo e metterla immediatamente in ghiaccio.
- Diluire il virus in DMEM + penna/strep senza FCS in base alla concentrazione dell'aliquota di RSV determinata al punto 1.3.2. Applicare una diluizione che dia circa 200 PFU/pozzetto. Preparare un volume totale di 5,5 mL (per 100 pozzetti).
- Preparazione della miscela virus-siero
- Aggiungere 55 μl del virus diluito a tutti i pozzetti delle colonne 1-9 e ai pozzetti delle righe E-H delle colonne 10 e 11 (controllo positivo) secondo il modello di piastra (Figura 4).
- Aggiungere 55 μL di DMEM + penna/strep senza FCS a tutti i pozzetti delle righe A-D delle colonne 10 e 11 (controllo negativo). Incubare la piastra per 1 ora a 37 °C, 5% CO2.
- Inoculazione del virus in cellule A549
- Prima del completamento del periodo di incubazione, recuperare la piastra o le piastre cellulari A549 preparate al punto 2.1.1. Assicurarsi che i monostrati di celle A549 nelle piastre a 96 pozzetti siano confluenti al ~80%.
- Scartare il supporto capovolgendo delicatamente la lastra e tamponandola leggermente su un tovagliolo di carta assorbente sterile. Lavare due volte tutti i pozzetti con 100 μL di PBS, scartare il PBS in eccesso capovolgendo delicatamente la piastra e tamponando leggermente su un tovagliolo di carta assorbente sterile dopo ogni lavaggio. Non lasciare asciugare le piastre.
- Trasferire 100 μL/pozzetto della miscela virus-siero nei pozzetti corrispondenti sulla piastra cellulare A549 seguendo il modello di piastra. Incubare la piastra per 1 ora a 37 °C, 5% CO2.
- Dopo 1 ora, utilizzando una pipetta, prelevare 90 μL/pozzetto e aggiungere 100 μL di 1x M199 preriscaldato + 1,5% CMC + 2% FCS + penna/streptococco. Incubare la piastra per 3 giorni a 37 °C, 5% CO2,
nota: Assicurarsi che la soluzione sia riscaldata a 37 °C prima di aggiungerla alle piastre.
- Sviluppo della piastra di analisi e del saggio (Giorno 5)
- Sviluppare la piastra di fissazione e di analisi seguendo i passaggi da 1.3.1.1 a 1.3.1.8.
- Determinare il titolo di neutralizzazione del 50%
- Determinare il titolo di neutralizzazione al 50% calcolando la distanza proporzionale tra le diluizioni reciproche del siero al di sopra e al di sotto del 50% dei pozzetti di controllo "senza siero" (controllo virale positivo - colonna 10, righe E-H).
- Contare il numero di PFU (cioè placche) derivanti da singole infezioni virali nei pozzetti del siero e senza pozzetti di controllo del siero. Calcolare il numero medio di PFU dei pozzetti di controllo senza siero e determinare il valore del 50%.
- Identificare le diluizioni sieriche con conta immediatamente superiore e inferiore al valore del 50% dei pozzetti di controllo senza siero. Utilizzando un grafico semi-logaritmico o un modello di foglio di calcolo, traccia il numero di PFU sull'asse x (scala lineare) e la diluizione reciproca del siero sull'asse y (scala logaritmica10). Tracciare una linea tra i due punti e leggere i titoli di neutralizzazione del 50% dei campioni di siero in esame da questa linea.
