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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione del buffer
- Tampone di marcatura (2x soluzione salina tamponata con fosfato, (PBS), pH 7,9): in 400 mL di acqua distillata deionizzata (DD), aggiungere 100 mL di 10x PBS, regolare il pH a 7,9 con idrossido di sodio (NaOH).
- 3 mM di biotina: Sciogliere 1 mg di biotina in 588 μl di tampone di marcatura.
- 3 mM di Sulfo-tag: Sciogliere 150 nmol di Sulfo-tag in 50 μL di tampone di marcatura.
- Tampone antigenico (5% BSA): in 500 ml di 1x PBS, aggiungere 25 g di albumina sierica bovina (BSA).
- Preparare una soluzione di acido acetico 0,5 M.
- 1,0 M di tampone Tris-HCl pH 9,0: Preparare 1 tampone Tris-HCl M e regolare il pH a 9,0 con HCl.
- Tampone di rivestimento (3% Blocker A): in 500 mL di 1x PBS, aggiungere 15 g di Blocker A.
- Tampone di lavaggio (0,05 % Tween 20, PBST): in 5000 mL di 1x PBS, aggiungere 2,5 mL di Tween 20.
- Tampone di lettura (2x Read Buffer T con tensioattivo): in 500 mL di acqua DD, aggiungere 500 mL di 4x Read Buffer T con tensioattivo (Tabella dei materiali).
- Conservare la biotina e il sulfo-tag in un congelatore a -20 °C.
nota: Sia la biotina che la soluzione di sulfo-tag devono essere sempre preparate al momento appena prima della procedura di etichettatura.
2. Etichetta l'autoantigene delle isole umane con biotina e sulfo-tag
NOTA: Un'alta concentrazione di antigene, ≥0,5 mg/mL, è raccomandata per una reazione di marcatura più efficiente.
- Determinare il rapporto molare dell'autoantigene delle isole umane per la biotina e il sulfo-tag.
- Ottenere il numero molare dell'antigene dividendo il peso dell'antigene per il peso molecolare.
- Utilizzare il rapporto molare di 1:5 per l'antigene con peso molecolare inferiore (≤10 kd) e il rapporto molare di 1:20 per l'antigene con peso molecolare maggiore (>50 kd).
- Calcolare il volume della biotina o del sulfo-tag dividendo il numero molare per la sua concentrazione.
- Mescolare l'autoantigene delle isole umane con biotina o sulfo-tag con il rapporto molare di 1:5,
nota: La proteina nei sistemi tampone tris o glicina deve essere sostituita con 2x tampone PBS con pH 7,9 utilizzando la colonna di spin di dimensionamento.
- Poiché la biotina e il sulfo-tag sono sensibili alla luce, coprire i tubi di reazione con un foglio di alluminio. Incubare la reazione a temperatura ambiente (RT) per 1 ora.
- Durante l'incubazione, adescare la colonna di centrifuga erogando tre volte 2 tamponi PBS nella colonna. Centrifugare la soluzione a 1000 x g per 2 minuti ogni volta.
nota: Attualmente la reazione di marcatura, attraverso il bridging, è ancora in corso e deve essere fermata.
- Arrestare la reazione di marcatura purificando l'autoantigene delle isole umane marcato. Per la purificazione, far passare l'autoantigene attraverso la colonna di centrifugazione e centrifugare la colonna a 1000 x g per 2 min.
- Determinare la concentrazione marcata dell'antigene (μg/μL) utilizzando la quantità di proteina dell'antigene e il volume finale.
nota: Approssimativamente, ci sarà una ritenzione del 90-95% dell'antigene marcato dopo ogni passaggio della colonna di rotazione.
- Aliquotare l'antigene marcato e conservare l'antigene marcato a -80 °C.
3. Definisci le migliori concentrazioni e rapporti per i due antigeni marcati per il test (Checker Board Assay)
- Preparare due campioni di siero, uno ad alto positivo e uno negativo, con un volume totale di 200 μl per ciascuno.
- Aliquotare 4 μl di siero e aggiungere 1x PBS fino a quando il volume finale è di 20 μl per pozzetto per una piastra di reazione a catena della polimerasi (PCR) a 96 pozzetti. Utilizzare metà di una piastra per il campione altamente positivo e l'altra metà per il campione negativo, come mostrato nella Figura 1A.
- Aggiungere 10 μL di Biotina e 10 μL di antigene marcato con Sulfo-tag ed eseguire diluizioni seriali per i due antigeni marcati in modo diverso, come mostrato nella Figura 1A. Eseguire una diluizione seriale orizzontale per un antigene marcato e una diluizione seriale verticale per l'altro antigene marcato.
- Continuare il resto delle fasi di analisi descritte nei punti da 5.3 a 9.1.
- Calcolare il rapporto tra i segnali provenienti dal campione altamente positivo e ciascuno dei segnali corrispondenti provenienti dal campione negativo mostrato nella Figura 1B.
- Identifica le migliori concentrazioni per gli antigeni marcati con biotina e sulfo selezionando un punto con il rapporto più alto o quasi più alto tra positivo e negativo. Considerare il basso segnale di fondo del campione negativo per identificare il rapporto.
nota: Il giorno 1 del saggio comprende le fasi da 4 a 6.
4. Prepara il tampone dell'antigene utilizzando la corretta concentrazione di antigene marcato con biotina/sulfo
- Selezionare la concentrazione razionale di ciascun antigene in base al test a scacchiera.
- Preparare 3 mL di soluzione antigenica per piastra, utilizzando la concentrazione razionale di antigene marcato con Biotina/Sulfo per il tampone antigenico.
5. Incubare campioni di siero con antigene marcato
NOTA: Ci sono due protocolli in questa sezione, uno senza trattamento con acido sierico e uno con trattamento con acido sierico. Tutti i test degli autoanticorpi delle isole insulari, ad eccezione del test degli autoanticorpi insulinici (IAA), utilizzano un protocollo regolare senza trattamento con acido sierico dalle fasi 5.1 a 5.5, mentre il test IAA salta queste fasi e utilizza il protocollo con trattamento con acido sierico dalle fasi 5.6 a 5.9.
- Aliquotare 4 μL di siero e aggiungere 1x PBS fino a quando il volume finale è di 20 μL per pozzetto per una piastra PCR a 96 pozzetti.
- Aggiungere 20 μl di soluzione di antigene marcato per pozzetto.
- Coprire la piastra PCR con un foglio sigillante per evitare la luce.
- Mettere la piastra su uno shaker (bassa velocità) a RT per 2 ore.
- Mettere la piastra in frigorifero a 4 °C e incubare per una notte (18 - 24 ore).
nota: Il seguente protocollo di passaggi da 5.6 a 5.9 è progettato solo per il test IAA e altri test di autoanticorpi saltano questi passaggi.
- Mescolare 15 μl di siero con 18 μl di acido acetico 0,5 M per ogni campione di siero. Incubare questa miscela a RT per 45 minuti.
- Preparare la soluzione antigenica con la concentrazione razionale di biotina e antigene marcato con Sulfo-tag, sulla base del test a scacchiera, utilizzando il tampone antigenico. In ogni pozzetto, aliquotare 35 μL di tampone antigenico, contenente biotina e antigene marcato con Sulfo-tag, in una nuova piastra PCR.
- Prima di terminare la fase di incubazione di 45 minuti (fase 5.6), aggiungere 8,3 μl di tampone Tris pH 9.0 da 1 M a lato di ciascun pozzetto sulla piastra dell'antigene (fase 5.6). È importante limitare la miscelazione tra il tampone Tris e l'antigene. Trasferire immediatamente 25 μl di siero, che viene trattato con acido, al punto 5.6, in ciascun pozzetto e agitare la soluzione. Coprire la piastra PCR con un foglio sigillante per evitare la luce.
- Mettere la piastra su uno shaker (bassa velocità) a RT per 2 ore. Mettere la piastra in frigorifero a 4 °C e lasciare incubare la piastra per una notte (18 - 24 ore).
6. Prepara la Piastra di Streptavidina
- Prendi una piastra di streptavidina dal frigorifero a 4 °C e lascia che la piastra arrivi a RT.
- Una volta che la piastra per streptavidina è a RT, aggiungere 150 μl di bloccante A al 3% a ciascun pozzetto.
- Coprire la piastra PCR con un foglio sigillante.
- Incubare la piastra in frigorifero a 4 °C per una notte.
NOTA: Il giorno 2 del saggio include le fasi da 7 a 9.
7. Trasferimento Siero/Antigene Incuba alla piastra di streptavidina
- Il giorno successivo, estrarre la piastra di streptavidina dal frigorifero e gettare il tampone dalla piastra. Metti dei tovaglioli di carta asciutti sul tavolo e picchietta la piastra a testa in giù fino a quando non c'è più tampone all'interno dei pozzetti.
- Riempire la piastra vuota per streptavidina con 150 μl di PBST per pozzetto ed eliminare il PBST dalla piastra per un totale di tre lavaggi.
- Trasferire 30 μL di siero/antigene incubato per pozzetto nella piastra per streptavidina.
- Coprire il piatto con un foglio di alluminio per evitare la luce. Agitare la piastra, a bassa temperatura, a RT per 1 ora.
8. Lava la piastra e aggiungi il buffer di lettura
- Scartare gli incubati dalla piastra. Aggiungere 150 μl di PBST per pozzetto ed eliminare il PBST dalla piastra per un totale di tre lavaggi.
- Dopo il lavaggio, aggiungere 150 μl per pozzetto di tampone di lettura.
nota: È importante evitare la formazione di bolle d'aria nella soluzione perché ciò influenzerà il modo in cui la lastra viene letta sulla macchina di lettura delle lastre.
