1. Innesto di gruppi funzionali amminici su dischi di carta di cellulosa
- Preparare un foglio di carta quadrata con una dimensione di 1 cm × 1 cm e 100 dischi di carta in carta di cellulosa di grado n. 1 con un diametro di 6,0 mm (carta da filtro a medio flusso) utilizzando una perforatrice.
- Per ricavare i gruppi -NH2 sui dischi di carta, miscelare 1 ml di 3-amminopropiltrimetossisilano (APS) e 10 ml di acetone in un flacone di vetro da 50 ml nella cappa aspirante. Aggiungere i dischi di carta alla miscela di reagenti APS appena preparata e incubare per 5 ore con agitazione orbitale (200 giri/min) a temperatura ambiente.
cautela: Maneggiare l'APS e l'acetone nella cappa aspirante.
- Decantare la soluzione in eccesso dal flacone di vetro da 50 ml in un contenitore per rifiuti organici.
- Aggiungere 10 ml di acetone al flacone di vetro, mescolare bene e decantare completamente per rimuovere eventuali APS non reagiti e altre impurità. Ripetere questo passaggio due volte.
- Stendere i dischi di carta sul tovagliolo di carta e metterli in forno a 110 °C per 3 ore. Lasciare raffreddare i dischi di carta. Conservare i dischi in una provetta da centrifuga da 50 ml a temperatura ambiente.
- Utilizzare la spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FTIR) per verificare l'innesto dei gruppi amminici sulla carta quadrata di cellulosa, come descritto di seguito (Figura 1A).
- Accendere il computer e aprire lo strumento di spettroscopia FTIR.
- Aprire il software per la spettroscopia FTIR.
- Vai su "Misurazione → inizializzazione". I rettangoli per 'BS: KBr', 'Lampada: Infrarossi' e 'Laser' diventeranno verdi al termine dell'inizializzazione.
- Scegli "Dati" sotto i rettangoli e seleziona "%Trasmittanza", "Happ-Genzel", "45", "4.0" e "Min: 400, Max: 4000" per "Modalità di misurazione", "Apodizzazione", "N. di scansioni", "Risoluzione" e "Intervallo (cm-1)".
- Fai clic su "Misura".
- Seleziona "File di dati" per i dati in background. Scrivi i commenti.
- Fai clic su "BKG" per ottenere la linea di base per lo sfondo.
- Fissare la carta quadrata sul supporto del campione di pellicola.
- Seleziona "File di dati" per i dati di esempio. Scrivi i commenti.
- Fare clic su "Campione" per ottenere gli spettri del campione.
- Chiudere l'applicazione di spettroscopia FTIR e spegnere il computer.
- Ripetere i passaggi precedenti (passaggi da 1.1 a 1.6) per preparare la carta quadrata di cellulosa n. 113 funzionalizzata con ammina e i dischi (carta da filtro a flusso rapido) e ottenere gli spettri FTIR per la carta quadrata di grado n. 113 (Figura 1B).
2. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) basato su carta per la rilevazione di immunoglobuline G (IgG)
- Aggiungere 5 ml di soluzione di glutaraldeide allo 0,05% (preparata in tampone PBS 50 mM, pH 7,4) in un flacone di vetro da 20 ml. Immergere 15 dischi di carta da filtro a medio flusso funzionalizzati con ammina in questa soluzione e conservare per 1 ora agitando a temperatura ambiente.
- Contemporaneamente, ripetere il passaggio 2.1 per preparare altri 15 dischi di carta da filtro a flusso rapido funzionalizzati con aldeide.
cautela: Maneggiare la glutaraldeide nella cappa aspirante.
- Per rimuovere la glutaraldeide non reagita dai dischi di carta, posizionare i 15 dischi di carta da filtro a flusso medio in una provetta da centrifuga da 15 ml e i 15 dischi di carta da filtro a flusso rapido in un'altra provetta da centrifuga da 15 ml. Aggiungere 5 ml di acqua deionizzata in ogni provetta e agitare le provette per 10 secondi. Togliere l'acqua aspirando con una pipetta. Ripetere due volte per rimuovere l'eventuale glutaraldeide non reagita.
- Asciugare i dischi di carta in forno a 37 °C.
- Aggiungere 5 μl e 8 μl di anticorpi del frammento IgG-Fc di topo 0,025 mg/ml a ciascuno dei dischi di carta da filtro a flusso medio e veloce, rispettivamente, e incubare per 20 minuti.
- Aggiungere 10 μl di 50 mM di PBS (pH 7,4) a ciascun disco di carta senza rimuovere gli anticorpi e incubare per 40 minuti per la reazione aldeidica amminica.
- Lavare i dischi di carta con 0,2 ml di tampone di lavaggio sopra un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte.
- Asciugare i dischi di carta in forno a 37 °C.
- Bloccare i dischi di carta con 15 μl di tampone bloccante per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare ogni disco di carta con 0,2 ml di tampone di lavaggio sopra un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte.
- Esegui gli standard IgG.
- Caricare 10 μl di varie concentrazioni di IgG (ad es. 0, 10, 125, 250 e 500 ng/ml in PBS) su ciascun disco in triplicato. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare i dischi di carta con 0,2 ml di tampone di lavaggio sopra un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte.
- Caricare 10 μl di anticorpi del frammento IgG-Fc di topo coniugato HRP (1:10.000, 10 mM PBS, pH 7,4) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare i dischi di carta con 0,2 ml di tampone di lavaggio sopra un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte.
nota: Non è necessario rimuovere il tampone di lavaggio in quanto i risultati non sono influenzati dalla presenza del tampone.
- Caricare una miscela da 10 μl di TMB e perossido di idrogeno su ciascun disco.
- Scatta immagini di tutti i dischi di carta con una fotocamera digitale o uno smartphone dopo 5 minuti di incubazione.
nota: Nella Figura 2A, "0" sta per i dischi di carta trattati con immobilizzazione degli anticorpi di cattura e la soluzione anticorpo-HRP/TMB senza siero IgG.
- Analizza l'intensità di ogni disco di carta nell'immagine dell'immagine J.
- Converti le immagini scattate nel passaggio 3.15 in formato ".tif".
- Apri il software "Image J".
- Vai su "File → Apri", scegli l'immagine da analizzare.
- Scegli il pulsante della forma 'Ovale'.
- Vai su "Tipo di immagine → → 32 bit".
- Vai su "Modifica → Inverti".
- Vai su "Analizza → misura".
- Copia e analizza i dati in un foglio di calcolo.
