1. Formazione del biofilm C. tropicalis
- Preparare i biofilm di Candida in una piastra per microtitolazione in polistirene a fondo piatto a 96 pozzetti, come descritto in precedenza (Figura 1).
- Aggiungere 100 μL di coltura di C. tropicalis (da 106 cellule/mL, preparati come sopra) a una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale (Figura 2A). Mantieni le ultime due colonne (11 e 12) come controlli negativi "nessun fungo più siero" e "nessun fungo e nessun siero" non aggiungendo cellule fungine. Riempire le colonne 11 e 12 con 100 μL di acido morfolinoprosolfonico (MOPS) 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
- Coprire la piastra per microtitolazione con un coperchio e un foglio di alluminio. Incubare la piastra per 24 ore a 37 °C in condizioni stazionarie.
- Il giorno successivo, aspirare accuratamente il terreno utilizzando una pipetta multicanale (senza toccare o interrompere i biofilm). Picchiettare delicatamente la lastra in posizione capovolta sui fogli assorbenti per rimuovere eventuali residui di supporto.
- Lavare la piastra con 200 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x (per pozzetto) utilizzando una pipetta multicanale. Aggiungere PBS molto delicatamente lungo le pareti laterali del pozzetto per evitare di interrompere i biofilm. Aspirare con cura il PBS utilizzando una pipetta multicanale. Ripetere il lavaggio PBS 2 volte (per un totale di tre lavaggi).
- Per rimuovere il PBS in eccesso, asciugare la piastra all'aria (senza coperchio) per 30 minuti a temperatura ambiente, all'interno di una cappa di sicurezza biologica.
2. Trattamento del biofilm con anticorpi
NOTA: I biofilm possono ora essere elaborati per valutare l'inibizione della maturazione del biofilm da parte degli anticorpi. Il siero murino è stato utilizzato come fonte di anticorpi policlonali. Diversi gruppi di Sap2-immunizzati (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis e Sap2-parapsilosis) insieme a topi immunizzati con sham sono stati dissanguati retro-orbitalmente e il siero è stato isolato. La presenza di anticorpi anti-Sap2 è stata confermata utilizzando il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) specifico per Sap2.
- Eseguire l'inattivazione termica del siero (fonte di anticorpi policlonali) a 56 °C per 30 minuti prima dell'uso per escludere il ruolo del complemento nell'attività inibitoria. Inattivare il siero a caldo prima di effettuare la diluizione del siero.
nota: Utilizzare il siero di topi immunizzati con sham, topi preimmuni e siero impoverito di anticorpi specifici per Sap2 come controlli aggiuntivi. Il siero impoverito di anticorpi è stato preparato secondo uno studio precedente. Tra le diluizioni seriali (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1.600, 1:3.200, 1:6.400 e 1:12.800) per il siero testato in questo protocollo, l'inibizione della maturazione del biofilm è stata osservata a 1:25, 1:50 e 1:100; Pertanto, 1:50 è stato selezionato per trovare un equilibrio tra inibizione e consumo di siero.
- Preparare diluizioni seriali di campioni di siero inattivati termicamente in terreno sterile RPMI 1640 MOPS (1:50). Utilizzare una comune diluizione del siero (1:50) per tutti i campioni di siero da testare per l'inibizione della maturazione del biofilm.
- Aggiungere 100 μl della diluizione del siero selezionata a ciascun pozzetto della piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Per ogni campione, aggiungere diluizioni di siero in duplicato, come da schema allegato (Figura 2B).
- Nella colonna 10, non aggiungere la diluizione del siero; aggiungere solo il terreno RPMI 1640 MOPS per il controllo positivo solo per i funghi><.
nota: La colonna 10, righe G1-G8 e H1-H8 inizialmente presentava cellule fungine in RPMI-MOPS. Tuttavia, mentre RPMI-MOPS è stato aggiunto alla colonna 10 anche dopo 24 ore, le righe G1-G8 sono servite come controllo PBS e le righe H1-H8 come controllo senza siero dopo 24 ore.
- Nella colonna 11, aggiungere una diluizione 1:50 di siero a tutti i pozzetti per fungere da controllo negativo senza funghi e siero.
- Nella colonna 12, non aggiungere la diluizione del siero a nessun pozzetto; mantenerla come il controllo negativo no fungus no sierum.
- Coprite il piatto con un coperchio e un foglio di alluminio. Incubare la piastra per 24 ore a 37 °C.
3. Stima dell'attività metabolica del biofilm
- Il giorno successivo, aspirare accuratamente il siero utilizzando una pipetta multicanale (senza toccare o interrompere i biofilm). Picchiettare delicatamente la piastra in posizione capovolta sui fogli assorbenti per rimuovere eventuali residui di siero.
- Lavare la piastra con 200 μl di 1x PBS (per pozzetto) utilizzando una pipetta multicanale, aggiungendo il PBS lungo le pareti laterali del pozzetto per evitare di interrompere i biofilm. Aspirare accuratamente il PBS utilizzando una pipetta multicanale e ripetere il lavaggio PBS 2 volte (per un totale di tre lavaggi). Asciugare la piastra all'aria (senza coperchio) per 30 minuti a temperatura ambiente, all'interno di una cappa di sicurezza biologica per asciugare l'eccesso di PBS.
- Preparazione di XTT(2,3-bis-(2-metossi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carbossanilide)/menadione:
- Preparare XTT in lattato sterile Ringers in una soluzione da 0,5 g/L. Sciogliere 25 mg di XTT in 50 mL di lattato Ringers sterilizzato con filtro. Aliquotare 10 mL in provette separate ricoperte con un foglio di alluminio e conservare a -80 °C.
- Preparare il menadione come brodo da 10 mM. Sciogliere 8,6 mg di menadione in 5 mL di acetone e distribuire 50 μL in 100 microprovette separate. Conservare le aliquote a -80 °C.
- Preparare la soluzione XTT/menadione appena prima dell'uso prelevando 10 mL di XTT e aggiungendo 1 μL di menadione per ottenere una soluzione di lavoro da 1 μM.
- Aggiungere 100 μl della soluzione XTT/menadione per pozzetto della piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Coprite il piatto con un coperchio e un foglio di alluminio. Incubare la piastra per 2 ore a 37 °C al buio.
- Trasferire 80 μl del surnatante colorato da ciascun pozzetto in una piastra fresca a 96 pozzetti. Leggere la targa a 490 nm.
- Calcolare la media dei valori di assorbanza dei pozzetti nella colonna 10 (controllo positivo solo fungo), che servirà come valore di riferimento per calcolare la percentuale di inibizione del biofilm da parte di ciascun campione di siero utilizzando l'equazione (1).
% inibizione del biofilm = 100 - 
× 100 (1)
