Un metodo basato sull'immunofluorescenza per la visualizzazione delle cellule del ciuffo nelle criosezioni di digiuno

Abstract

Fonte: Mizutani, Y. et al., Uso di anticorpi anti-fosfo-girdina per visualizzare le cellule del ciuffo intestinale nelle criosezioni di digiuno di topo fluttuanti.J. Vis. Exp. (2018)

Questo video illustra un metodo basato sull'immunofluorescenza per visualizzare le cellule del ciuffo intestinale in criosezioni di digiuno di topo fluttuanti. All'interno dei villi intestinali, la co-localizzazione della fluorescenza verde all'apice luminale con una massa estesa di radichette rosse indica la presenza di cellule del ciuffo.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparativi

1. Preparare 10 L di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): 32,27 g di sodio idrogeno fosfato (Na₂HPO₄·12H₂O), 4,5 g di sodio diidrogeno fosfato (NaH₂PO₄·2H₂O), 80,0 g di sodio cloruro (NaCl) aggiunti ad acqua ultrapura fino a un volume finale di 10 L. Conservare la soluzione a temperatura ambiente (RT).
2. Preparare 200 mL di PBS-T: 200 mL di PBS dal passaggio 1.1 con 100 μL di poliossietilene (10) ottilfenil etere a una concentrazione finale dello 0,05% (vol: vol). Negozio presso RT.
3. Indossando guanti e protezione per gli occhi, preparare 50 mL di saccarosio al 15% in una soluzione di formalina neutra tamponata al 10%: 7,5 g di saccarosio aggiunti alla soluzione di formalina neutra tamponata al 10% (Tabella dei materiali) fino a un volume finale di 50 mL. Negozio su RT.
   cautela: L'inalazione e/o il contatto pelle/occhi con formaldeide in una soluzione di formalina neutra tamponata al 10% possono essere pericolosi. Maneggiare con cautela.
4. Preparare 1,5 mL di 200 unità/mL di soluzione madre coniugata di colorante fluorescente falloidina: coniugato colorante fluorescente falloidina (300 unità in 1 fiala, solidi liofilizzati, lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione: 581 nm e 609 nm, rispettivamente) sospeso in 1,5 mL di metanolo. Conservare la soluzione al buio a -20 °C.
5. Preparare 5 mg/mL di soluzione madre di 4',6-diamidino-2-fenilindolo, dicloridrato (DAPI): 10 mg di DAPI in 2 mL di N, N-dimetilformammide (DMF). Conservare la soluzione al buio a -20 °C.
6. Preparare il 5% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS: 0,5 g di BSA, 10 ml di PBS. Conservare a 4 °C.
7. Rimuovere la punta smussata di un ago dritto calibro 18 utilizzando una tronchesa e pizzicare l'estremità tagliata con una pinza in senso longitudinale per consentire al liquido di fluire attraverso il lume dell'ago (Figura 1A1).
   nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. Dissezione animale e isolamento di Jejunum

1. Fissazione per perfusione di un topo
   1. Indossare i guanti e lavorare in un'area ben ventilata.
   2. Preparare un becher di vetro da 100 mL, una soluzione di formalina neutra tamponata al 10%, strumenti chirurgici (forbici, pinze), un vassoio metallico, suture tagliate in nylon 6-0, un ago dritto calibro 18 preparato come in 1.7, un ago alato calibro 22, una siringa da 20 mL.
   3. Caricare 20 mL di soluzione di formalina neutra tamponata al 10% dal becher di vetro nella siringa da 20 mL e collegare l'ago alato calibro 22 all'uscita.
   4. Preparare la gelatina liquida aggiungendo 1 g di gelatina in polvere a 20 ml di PBS (5% di gelatina finale) in una provetta da centrifuga da 50 ml. Dopo l'immersione in RT per 15 minuti, incubare a 50 °C a bagnomaria per 15 minuti senza agitare.
   5. Agitare brevemente e incubare a 50 °C per altri 15 minuti per sciogliere completamente la gelatina. Lasciare il tubo in RT fino al momento dell'uso.
   6. Eutanasia di un topo adulto mediante lussazione cervicale.
   7. Posizionare il mouse del passaggio 2.1.6 su un vassoio metallico e praticare una piccola incisione sulla pelle attraverso la cartilagine ensiforme utilizzando strumenti chirurgici.
   8. Espandi l'incisione con entrambe le mani per esporre le regioni toracica e addominale.
   9. Aprire il peritoneo per esporre il diaframma, quindi aprire il diaframma su entrambi i lati.
   10. Tagliare la gabbia toracica lungo le linee ascellari anteriori su entrambi i lati, quindi rimuovere la parete toracica tagliando in direzione trasversale nella posizione del timo per esporre il cuore.
   11. Fai una piccola incisione sul padiglione auricolare dell'atrio destro per drenare il sangue e inserisci un ago alato calibro 22 nell'apice del ventricolo sinistro. Spingere lo stantuffo per perfondere i tessuti con una soluzione di formalina neutra tamponata al 10%.
   12. Dopo aver esposto gli organi nel bacino, tagliare l'estremità del retto dall'ano e separare l'intestino dal corpo tagliando il mesentere.
   13. Per isolare il digiuno, tagliare l'intestino a 4 cm dal lato anale dell'antro gastrico. Scartare la metà anale dell'intestino tenue rimasto.
   14. Tagliare il digiuno a metà per facilitare la procedura di lavaggio. Caricare 20 mL di soluzione di formalina neutra tamponata al 10% nella siringa da 20 mL e collegare l'ago dritto calibro 18 preparato al punto 1.7 all'uscita.
   15. Iniettare una soluzione di formalina neutra tamponata al 10% da un'estremità del digiuno tagliato per eliminare il contenuto intestinale e fissare la superficie del lume intestinale (Figura 1A2).
   16. Lavare il lume intestinale iniettando PBS come descritto al punto 2.1.15.
   17. Lavare la gelatina liquida nel lume intestinale come descritto al punto 2.1.15 per sostituire la PBS con la gelatina liquida.
   18. Chiudere un'estremità del digiuno tagliato mediante legatura di sutura utilizzando una sutura tagliata in nylon 6-0, riempire il digiuno con gelatina liquida e chiudere l'estremità opposta mediante legatura di sutura (Figura 1A3).
   19. Aggiungere quattro nodi di sutura per adattare una sezione di digiuno a forma di salsiccia alla parte depressa di un criomold (Figura 1A4).
       nota: Per i criostampi con una sezione depressa di 20 mm x 25 mm x 5 mm, è preferibile una sezione di digiuno a salsiccia di ~20 mm.
   20. Immergere i tessuti in 50 ml di saccarosio al 15% in una soluzione di formalina neutra tamponata al 10% per una notte a 4 °C.
       nota: Questi passaggi garantiscono la crioprotezione mediante saccarosio e la fissazione delle proteine mediante formalina di gelatina e tessuto. La gelatina gelatinizzata in formalina non si scioglie a RT, mentre la gelatina gelatinizzata non fissata a 4 °C fonde a RT.

3. Congelamento rapido di tessuti di digiuno ripieni di gelatina

1. Tagliando il digiuno in corrispondenza dei nodi di sutura, si ottengono tre pezzi di digiuno simili a salsicce con entrambe le estremità legate (Figura 1A4). Allineare i pezzi simili a salsicce in un criomold per l'aggiunta di composto di inclusione per la preparazione di campioni di tessuto congelati.
2. Congelare a scatto il criomold in isopentano raffreddato con azoto liquido. Conservare i criostampi a -80 °C
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. Immunofluorescenza di cellule a ciuffo utilizzando criosezioni flottanti

1. Criosezione
   1. Impostare sia la temperatura della camera del criostato (CT) che la temperatura dell'oggetto (OT) a -22 °C. Posizionare il blocco di tessuto congelato in un criopoldo nella camera del criostato per almeno 15 minuti.
   2. Aggiungere 3 ml di PBS a un piatto di coltura da 35 mm.
   3. Rimuovere il blocco di tessuto congelato dal cryomold e tagliare il blocco a metà con una lama di rasoio per esporre la sezione trasversale del digiuno. Montare una metà del blocco su un mandrino (un adattatore per criostato) per sezionare il piano di taglio con la lama del rasoio.
   4. Sezionare il digiuno ripieno di gelatina in sezioni spesse 30 μm. Utilizzare una pinza congelata per trasferire delicatamente le sezioni nel piatto di coltura da 35 mm preparato al punto 4.1.2 (Figura 2B, a destra).
2. Applicazione di anticorpi primari
   1. Lavare le sezioni flottanti nella piastra di coltura da 35 mm 3 volte per 5 minuti ciascuna con 3 mL di PBS-T agitando leggermente su un agitatore reciproco (circa 36 volte/min).
   2. Preparare la soluzione per il recupero dell'antigene: 0,3 mL di concentrato per il recupero dell'antigene (Tabella dei materiali) in 2,7 mL di acqua ultrapura. Aggiungere 3 mL di soluzione per il recupero dell'antigene alla piastra di coltura da 35 mm contenente sezioni flottanti.
   3. Chiudere il coperchio, sigillare lo spazio tra la capsula e il coperchio con una striscia di nastro adesivo in vinile e incubare a 50 °C in un'incubatrice di ibridazione per 3 ore senza agitare.
   4. Togliete la pirofila dall'incubatrice e raffreddatela a RT per 20 min. Dopo aver rimosso il nastro in vinile, lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuna con 3 ml di PBS-T e agitando leggermente.
   5. Aspirare il PBS-T e aggiungere 5 gocce di soluzione bloccante (Tabella dei materiali) sulle sezioni. Incubare a RT per 5 minuti agitando leggermente.
   6. Preparare la soluzione di anticorpi primari: 495 μL di BSA al 5% in PBS con 5 μL di anticorpi fosfo-Y1798 girdina (pY1798) (Tabella dei materiali). Aggiungere 500 μl di soluzione di anticorpi primari sulle sezioni (non è necessario rimuovere la soluzione bloccante).
   7. Porre la capsula in una camera di incubazione umidificata e incubare per una notte a 4 °C agitando leggermente.
      nota: L'incubazione notturna può essere estesa fino a tre notti.
3. Applicazione di anticorpi secondari
   1. Lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuna in 3 ml di PBS-T agitando leggermente.
   2. Preparare la soluzione madre DAPI diluita: 2 μL di soluzione madre DAPI (Passaggio 1.5), 998 μL di PBS.
   3. Preparare la soluzione di anticorpi secondari: 476 μL di BSA al 5% in PBS, 10,5 μL di soluzione DAPI diluita, 12,5 μL di soluzione madre coniugata di colorante fluorescente falloidina, 1 μL di colorante fluorescente IgG di capra coniugato (lunghezza d'onda: eccitazione 496 nm, emissione 520 nm).
   4. Dopo aver aspirato il PBS-T, applicare la soluzione di anticorpi secondari e incubare in una camera di incubazione schermata dalla luce a RT per 30 minuti con un leggero agitamento.
   5. Lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuna con 3 ml di PBS-T e agitando leggermente.
   6. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il PBS-T e sostituirlo con 3 ml di PBS privo di poliossietilene(10) ottilfenil etere. Trasferire la capsula in un microscopio stereoscopico.
   7. Posizionare 200 μl di PBS in una gocciolina al centro di un vetrino di vetro bianco rivestito di MAS e trasferire una sezione di digiuno dalla capsula alla gocciolina utilizzando un puntale per pipetta P200.
   8. Dopo aver regolato l'allineamento della sezione al microscopio stereoscopico, aspirare tutto il PBS rimanente che circonda la sezione.
   9. Aggiungere 20 μl di terreno di montaggio acquoso e posizionare un vetrino coprioggetti da 20 x 20 mm sopra il supporto.
   10. Sigillare immediatamente i bordi del vetrino coprioggetto con mezzi di montaggio a base di xilene. Posizionare il vetrino su una mappa di legno e lasciare che il supporto di montaggio a base di xilene si solidifichi a RT per 2 - 3 ore.
       nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Dopo che il mezzo di montaggio a base di xilene si è solidificato, i vetrini possono essere conservati per 2 - 3 settimane in una scatola per vetrini schermata dalla luce presso RT.

5. Microscopia confocale

1. Mettere l'olio da immersione sull'obiettivo 63X di un microscopio confocale. Abbassare il vetrino coprioggetti e posizionarlo sul tavolino.
2. Digitalizza le immagini TC acquisite alle lunghezze d'onda laser 405, 488 e 555 nm e salva le immagini in formato tiff (.tiff).
   nota: Scegliere un set di filtri di rilevamento appropriato per i coloranti a fluorescenza (ad esempio, massimi di eccitazione/emissione: 358/461 nm, 490/525 e 590/617).

Results

Figura 1: Riempimento in gelatina di sezioni di digiuno per la conservazione morfologica delle criosezioni
(A) Fotografie delle procedure per il riempimento intraluminale del digiuno di topo con gelatina. (A1) La punta smussata di un ago dritto calibro 18 è stata rimossa per evitare di perforare la parete intestinale. (A2) Una soluzione di forma...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slc:DDY Topi femmina di 6 settimane	Chubu Kagaku Shizai	Non applicabile
Idrogenofosfato disodico 12-acqua (Na2HPO412H2O)	Wako	Codice 196-02835
Sodio diidroenfosfato diidrato (NaH2PO42H2O	Wako	Codice 199-02825
Cloruro di sodio (NaCl)	Wako	Codice 199-10665
Triton X-100, etere di poliossietilene(10) ottilfenile	Katayama Chimico	Non applicabile
saccarosio	Wako	Codice 190-00013
Soluzione di formalina neutra tamponata al 10%	Muto Chimico	Anno 20215	Passaggio 1.3.
Coniugato colorante falloidina-fluorescente, falloidina Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientifico	Codice A12381
metanolo	Nacalai Tesque	Codice: 21915-35
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo, dicloridrato)	ThermoFisher Scientifico	D1306
N.N-dimetilformammide (DMF)	Nacalai Tesque	Codice: 13015-75
Albumina sierica bovina	sigma	Codice A9647-10G
Ago dritto in acciaio inossidabile calibro 18	Terumo	NN-1838R
U.S.P. 6-0, sutura taglio nylon 60 cm, Crownjun	Kono Seisakusho	Non applicabile
Ago alato calibro 22	Terumo	SV-22DLK
Siringa TERUMO da 20 mL	Terumo	SS-20ES
Provetta da centrifuga da 50 mL	TPP	Codice 91050
Provette da centrifuga Iwaki da 15 mL	Iwaki	Codice 2325-015
Micro provetta da 1,5 mL	stella	RSV-MTT1.5
Gelatina in polvere, Gelare-blanc	Nitta Biolab	Codice: 2809
Composto di inclusione per campione di tessuto congelato, O.C.T. Compound 118 mL 12 pezzi	Sakura FineTech	4583
Cryomold, CRYO DISH n. 3, 125 pezzi, pozzetto 20 x 25 x 5 (mm)	Di Shoei Work	Codice: 1101-3
Isopentano	Nacalai Tesque	Codice 26404-75
Piatto per coltura cellulare Falcon 35 x 10mm Easy-Grip	Corning	353001
Soluzione concentrata per il recupero dell'antigene, soluzione per il recupero del bersaglio pH 9 10x	Dako	Episodio 2367	Concentrato di soluzione per il recupero dell'antigene al punto 4.2.2.
Blocco proteico	Dako	Visualizzazione X0909	Soluzione bloccante in 4.2.5.
Anticorpi Fosfo-Y1798 girdina (pY1798)	Laboratori di Immunobiologia (IBL) = Azienda X	Codice 28143	Anticorpi Fosfo-Y1798 girdina al passaggio 4.2.6.
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio IgG di capra (H+L), Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientifico	Codice A11034
Supporti di montaggio acquosi, Montante antisbiadimento Prolong Gold	ThermoFisher Scientifico	P36930
Vetrini coprioggetti, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pz Spessore N.1	Vetro Matsunami	C022221
Entellan Nuovi mezzi di montaggio a base di xilene per microscopia	Merck Millipore	107961
Vetro per vetrini con rivestimento MAS bianco	Vetro Matsunami	MI-MAS-01
Mappe in legno tipo KO	Di Shoei Work	99-40007
Olio da immersione 518 F senza fluorescenza 20 ml	Zeiss	Numero 444960
Pipette, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)	Gilson	F144801, F123600, F123601, F123602
Sistema di produzione di acqua ultrapura	Advantec	GS-590
Guanto di plastica, guanto in nitrile Star	stella	RSU-NGVM
criostato	Leica Microsystems	CM1950
Congelatore, SANYO Ultra Low	Sanyo	in MDF-382
Frigorifero da vetrina	Congelatore Nihon	NC-ME50EC
Bagnomaria, Thermominder SDminiN (per sciogliere la gelatina a 50 C)	Taitec	Codice 0068750-000
Incubatore di ibridazione (per il prelievo dell'antigene a 50 C)	Taitec	HB-100
Camera di incubazione per immunocolorazione	Cosmo Bio	10FARE
Agitatore reciproco per immunoistochimica (per temperatura ambiente)	Taitec	NR-1
Agitatore reciproco per immunoistochimica (per 4 C)	Tokyo Rika Kikai	MMS-3010
Microscopio stereoscopico (per la manipolazione dei tessuti)	Olimpo	SZ61
Microscopio stereoscopico (per la Figura 1B)	Leica Microsystems	Motore M165FC
Microscopio a fluorescenza (per la Figura 3)	Nikon	E800
Microscopio confocale a scansione laser	Zeiss	Pannello LSM700