Method Article

Un metodo basato sull'immunofluorescenza per la visualizzazione delle cellule del ciuffo nelle criosezioni di digiuno

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonte: Mizutani, Y. et al., Uso di anticorpi anti-fosfo-girdina per visualizzare le cellule del ciuffo intestinale nelle criosezioni di digiuno di topo fluttuanti.J. Vis. Exp. (2018)

Questo video illustra un metodo basato sull'immunofluorescenza per visualizzare le cellule del ciuffo intestinale in criosezioni di digiuno di topo fluttuanti. All'interno dei villi intestinali, la co-localizzazione della fluorescenza verde all'apice luminale con una massa estesa di radichette rosse indica la presenza di cellule del ciuffo.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparativi

  1. Preparare 10 L di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): 32,27 g di sodio idrogeno fosfato (Na2HPO4·12H2O), 4,5 g di sodio diidrogeno fosfato (NaH2PO4·2H2O), 80,0 g di sodio cloruro (NaCl) aggiunti ad acqua ultrapura fino a un volume finale di 10 L. Conservare la soluzione a temperatura ambiente (RT).
  2. Preparare 200 mL di PBS-T: 200 mL di PBS....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Figura 1: Riempimento in gelatina di sezioni di digiuno per la conservazione morfologica delle criosezioni
(A) Fotografie delle procedure per il riempimento intraluminale del digiuno di topo con gelatina. (A1) La punta smussata di un ago dritto calibro 18 è stata rimossa per evitare di perforare la parete intestinale. (A2) Una soluzione di forma.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Slc:DDY Topi femmina di 6 settimaneChubu Kagaku ShizaiNon applicabile
Idrogenofosfato disodico 12-acqua (Na2HPO412H2O)WakoCodice 196-02835
Sodio diidroenfosfato diidrato (NaH2PO42H2OWakoCodice 199-02825
Cloruro di sodio (NaCl)WakoCodice 199-10665
Triton X-100, etere di poliossietilene(10) ottilfenileKatayama ChimicoNon applicabile
saccarosioWakoCodice 190-00013
Soluzione di formalina neutra tamponata al 10%Muto ChimicoAnno 20215Passaggio 1.3.
Coniugato colorante falloidina-fluorescente, falloidina Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificoCodice A12381
metanoloNacalai TesqueCodice: 21915-35
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo, dicloridrato)ThermoFisher ScientificoD1306
N.N-dimetilformammide (DMF)Nacalai TesqueCodice: 13015-75
Albumina sierica bovinasigmaCodice A9647-10G
Ago dritto in acciaio inossidabile calibro 18TerumoNN-1838R
U.S.P. 6-0, sutura taglio nylon 60 cm, CrownjunKono SeisakushoNon applicabile
Ago alato calibro 22TerumoSV-22DLK
Siringa TERUMO da 20 mLTerumoSS-20ES
Provetta da centrifuga da 50 mLTPPCodice 91050
Provette da centrifuga Iwaki da 15 mLIwakiCodice 2325-015
Micro provetta da 1,5 mLstellaRSV-MTT1.5
Gelatina in polvere, Gelare-blancNitta BiolabCodice: 2809
Composto di inclusione per campione di tessuto congelato, O.C.T. Compound 118 mL 12 pezziSakura FineTech4583
Cryomold, CRYO DISH n. 3, 125 pezzi, pozzetto 20 x 25 x 5 (mm)Di Shoei WorkCodice: 1101-3
IsopentanoNacalai TesqueCodice 26404-75
Piatto per coltura cellulare Falcon 35 x 10mm Easy-GripCorning353001
Soluzione concentrata per il recupero dell'antigene, soluzione per il recupero del bersaglio pH 9 10xDakoEpisodio 2367Concentrato di soluzione per il recupero dell'antigene al punto 4.2.2.
Blocco proteicoDakoVisualizzazione X0909Soluzione bloccante in 4.2.5.
Anticorpi Fosfo-Y1798 girdina (pY1798)Laboratori di Immunobiologia (IBL) = Azienda XCodice 28143Anticorpi Fosfo-Y1798 girdina al passaggio 4.2.6.
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio IgG di capra (H+L), Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificoCodice A11034
Supporti di montaggio acquosi, Montante antisbiadimento Prolong GoldThermoFisher ScientificoP36930
Vetrini coprioggetti, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pz Spessore N.1Vetro MatsunamiC022221
Entellan Nuovi mezzi di montaggio a base di xilene per microscopiaMerck Millipore107961
Vetro per vetrini con rivestimento MAS biancoVetro MatsunamiMI-MAS-01
Mappe in legno tipo KODi Shoei Work99-40007
Olio da immersione 518 F senza fluorescenza 20 mlZeissNumero 444960
Pipette, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)GilsonF144801, F123600, F123601, F123602
Sistema di produzione di acqua ultrapuraAdvantecGS-590
Guanto di plastica, guanto in nitrile StarstellaRSU-NGVM
criostatoLeica MicrosystemsCM1950
Congelatore, SANYO Ultra LowSanyoin MDF-382
Frigorifero da vetrinaCongelatore NihonNC-ME50EC
Bagnomaria, Thermominder SDminiN (per sciogliere la gelatina a 50 C)TaitecCodice 0068750-000
Incubatore di ibridazione (per il prelievo dell'antigene a 50 C)TaitecHB-100
Camera di incubazione per immunocolorazioneCosmo Bio10FARE
Agitatore reciproco per immunoistochimica (per temperatura ambiente)TaitecNR-1
Agitatore reciproco per immunoistochimica (per 4 C)Tokyo Rika KikaiMMS-3010
Microscopio stereoscopico (per la manipolazione dei tessuti)OlimpoSZ61
Microscopio stereoscopico (per la Figura 1B)Leica MicrosystemsMotore M165FC
Microscopio a fluorescenza (per la Figura 3)NikonE800
Microscopio confocale a scansione laserZeissPannello LSM700

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tuft CellsImmunofluorescence MethodJejunum CryosectionsConfocal MicroscopyAntigen RetrievalPhalloidin StainingDNA Binding DyePrimary AntibodiesSecondary AntibodiesMounting Media

Related Articles