Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Trasfezione di cellule 293T con luciferasi e raccolta di surnatante virale
- Coltura di cellule 293T
- Preparare i terreni aggiungendo quanto segue a un litro di terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco ciascuno: 110 ml di siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS), 11 ml di penicillina-streptomicina.
- Scongelare 5 x 106 cellule 293T e trasferirle in un matraccio T175 con il terreno preparato come descritto sopra.
- Dividi le celle 293T 1:10 ogni 3 giorni per 6 giorni. Non lasciare che le cellule diventino confluenti per più del 90%.
- Trasfezione di cellule 293T
nota: Le seguenti quantità di reagenti sono calcolate per la trasfezione di un pallone T175 di cellule 293T. Regolare di conseguenza se devono essere trasdotte più fiasche.
- Trasferire 1,5 mL di terreno in ciascuna delle due provette da 50 mL utilizzando una pipetta. In una provetta, aggiungere 10 μg di plasmide VSV-G, 20 μg di Gag/pol e 20 μg di plasmide luciferasi click beetle red TD tomato (CBR-TDR) e mescolare. All'altra provetta, aggiungere 100 μL di reagente di trasfezione in vitro di DNA e mescolare. Incubare entrambe le provette a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
nota: Tutti i plasmidi descritti in questo manoscritto sono stati forniti dal Dr. Vladimir Ponomarev.
- Trasferire il terreno contenente il reagente di trasfezione del DNA in vitro goccia a goccia nella provetta contenente i plasmidi del DNA (oltre circa 30 s) e mescolare delicatamente con una pipetta. Incubare a RT per 20 min.
- Durante questa incubazione di 20 minuti, staccare le cellule 293T aggiungendo 5-10 mL di tripsina allo 0,05%. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere 10 mL di terreno e centrifugare a 800 x g per 5 minuti. Risospendere le cellule in 1,5 mL di terreno.
- Aggiungere il terreno contenente il reagente di trasfezione del DNA in vitro e i plasmidi del DNA alle cellule 293T e incubare a 37 °C per 30 minuti.
- Trasferire in un matraccio T175 e aggiungere 18 mL di terreno. Incubare a 37 °C per una notte.
- Il giorno successivo, aspirare accuratamente il terreno con una pipetta di vetro senza staccare le cellule. Sostituire con 18 ml di terreno fresco. Incubare a 37 °C per una notte in un'incubatrice.
- Raccolta del surnatante virale
- Rimuovere il surnatante virale utilizzando una pipetta messa sul ghiaccio. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti per pellettare le celle e i detriti.
nota: Se il pellet cellulare è grande, è probabile che le cellule siano state distrutte dal pallone quando il surnatante è stato rimosso. Queste celle possono essere nuovamente piastrate in un nuovo pallone con terreno fresco.
- Filtrare il surnatante virale utilizzando un filtro da 0,22 μm.
- Utilizzare immediatamente il surnatante virale. Conservarlo in ghiaccio o a 4 °C per un massimo di 24 ore, oppure congelarlo a -80 °C per una conservazione a lungo termine.
2. Espansione e trasduzione di cellule T umane attivate con luciferasi
- Attivazione di cellule T umane in vitro
- Lavare le perle aggiungendo 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in una provetta sterile da 15 mL, aggiungendo perle (una perlina ogni due cellule T), mettendole in una rastrelliera magnetica per 2 minuti e aspirando il PBS.
- Preparare il terreno come descritto al punto 1.1.1, quindi aggiungere IL-2 a una concentrazione finale di 30 UI/mL e aggiungere le perle lavate. Produrre 2,5 mL di terreno per ogni due milioni di cellule T da attivare.
- Contare le cellule T (appena purificate o precedentemente purificate, congelate, scongelate e lavate) utilizzando un emocitometro e una colorazione blu di tripano. Aggiungere le cellule T al terreno preparato al punto 2.1.2 e capovolgere delicatamente la provetta per mescolare. Le cellule T si espanderanno almeno 20 volte a seconda della fonte e della salute generale delle cellule. Determina il numero di cellule T da attivare calcolando il numero necessario per trattare i topi e dividendo per 20. Qui, sono state utilizzate 20 x 106 cellule T per topo sulla base di esperimenti preliminari.
- Piastra da 2,5 mL di terreno contenente due milioni di cellule T, perline e (interleuchina 2) IL-2 in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Coltura a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2.
- Esamina le cellule T con un microscopio 20x ogni giorno per i prossimi 3 giorni per determinare quando trasdurre con la luciferasi. Le cellule sono pronte quando si aggregano e esauriscono il terreno, trasformandolo da rosso/rosa ad arancione chiaro.
- Preparazione di piastre di retronectina
nota: La retronectina viene utilizzata per rivestire le piastre utilizzate nella trasduzione in quanto migliora la trasduzione genica.
- Aggiungere 2 mL di 20 μg/mL di retronectina in PBS a un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti non trattata. Incubare per 2 ore a RT o 1 ora a 37 °C. È necessario un pozzetto rivestito di retronectina per ogni due milioni di cellule T da trasdurre.
- Aspirare la retronectina senza graffiare il fondo della piastra.
- Aggiungere 3 mL di BSA al 2% in PBS (filtrato sterile) per pozzetto nella piastra a 6 pozzetti. Incubare per 30 minuti a RT.
- Spinoculazione
- Aspirare il BSA senza graffiare il fondo della piastra.
- Lavare i pozzetti una volta con 3 ml di PBS per pozzetto. Continuare o sostituire con PBS fresco e lasciare la piastra coperta a 4 °C per una notte.
- Aggiungere 2 mL di surnatante virale della luciferasi CBR-TDR (raccolto al punto 1.3) per pozzetto.
- Centrifugare a 1,240 x g per 90 min a 32 °C.
- trasduzione
- Conta le cellule T.
- Aspirare il surnatante virale senza graffiare il fondo della piastra.
- Piastra due milioni di cellule T per pozzetto in 6 mL di DMEM contenenti 30 UI/mL di IL-2 umana.
- Esamina le cellule T ogni giorno. Le cellule T sono pronte per essere espanse quando sono quasi confluenti, di solito dopo 2 giorni.
- Quando le cellule sono quasi confluenti, lavarle delicatamente dal fondo della piastra con una pipetta e trasferire ciascun pozzetto in un pallone T75 separato. Aggiungere 9 mL di terreno per un totale di 15 mL di terreno per pallone.
- Il giorno successivo, aggiungere altri 15 ml di terreno. Le cellule dovrebbero essere pronte per essere iniettate nei topi il giorno dopo questa aggiunta di terreno. Confermare la corretta trasduzione eseguendo la citometria a flusso (il costrutto della luciferasi contiene un fluoroforo di pomodoro TD visibile nel canale PE).
3. Attecchimento di cellule T trasdotte con luciferasi in topi immunocompromessi
- Preparare e contare le cellule T per l'iniezione.
- Rimuovere le cellule T dai matracci e contare. Le cellule sono pronte per l'iniezione quando si sono espanse di 20-30 volte, di solito entro il 7° giorno dopo l'attivazione.
- Centrifugare le cellule T a 800 x g per 5 minuti. Risospendere in 2 mL di terreno e rimuovere le perle utilizzando una rastrelliera magnetica.
- Per gli esperimenti in cui le cellule T saranno iniettate separatamente dagli anticorpi bispecifici, contare le cellule T e risospendere in modo che la concentrazione finale sia di 20 milioni di cellule T per 100 μL di terreno. Andare al passaggio 3.2. Per gli esperimenti che utilizzano cellule T armate ex vivo (EAT), andare al passaggio 3.1.4.
- Per gli esperimenti che utilizzano cellule T armate ex vivo, contare le cellule T e separarle in singole provette da 1,5 ml per ciascun gruppo, con 20 milioni di cellule per topo. Ad esempio, se ci sono tre gruppi di cinque topi ciascuno, preparare tre provette da 1,5 ml con 100 milioni di cellule T ciascuna.
- Centrifugare le provette da 1,5 mL a 800 x g per 5 minuti. Rimuovere il terreno con cautela senza disturbare il pellet delle cellule T. Risospendere in non più di 50 μl di terreno contenente gli anticorpi bispecifici. Incubare a RT per 30 min.
nota: Ai fini degli esperimenti condotti in questo studio, sono stati utilizzati anticorpi bispecifici proprietari che coinvolgono le cellule T IgG-[L]-scFv generati in laboratorio. Per l'armamento delle cellule T, utilizzare 5 μg di anticorpo per 20 x 106 cellule T. Potrebbero essere utilizzati anche anticorpi bispecifici disponibili in commercio.
- Eliminare gli anticorpi in eccesso aggiungendo 1.450 μl di terreno in ciascuna provetta. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti, aspirare accuratamente il terreno e risospendere a una concentrazione di 20 milioni di cellule T armate per 100 μL di terreno.
- Iniezione e attecchimento nei topi
- Anestetizzare i topi in una camera che fornisca il 3,5% (v/v) di isoflurano inalato in 1 L/min di ossigeno. I topi vengono completamente anestetizzati quando il riflesso di ritiro del pedale dell'arto posteriore è scomparso.
NOTA: Fornire supporto termico durante tutta la procedura.
- Utilizzando un ago da 26 G, iniettare 20 milioni di cellule T in 100 μL di terreno per via retroorbitale per topo.
- Somministrare 1.000 U di IL-2 ricombinante per via sottocutanea per supportare la sopravvivenza delle cellule T in vivo.
- Somministrare gli anticorpi bispecifici per via retroorbitale (nell'occhio non utilizzato per l'iniezione delle cellule T) o per via intraperitoneale. Lascia che i topi si riprendano dall'anestesia e tornino nelle loro gabbie.
NOTA: Ancora una volta, in questo caso, sono stati utilizzati anticorpi proprietari generati in laboratorio, ma potrebbero essere utilizzati anticorpi disponibili in commercio. Negli esperimenti qui, sono stati somministrati 0,3-10 μg di anticorpi per topo per dose. Gli anticorpi sono stati somministrati due volte a settimana per 3-4 settimane.
4. Imaging in vivo di topi trapiantati con cellule T trasdotte con luciferasi
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito il giorno dell'imaging, che non è necessariamente lo stesso giorno in cui le cellule T e/o gli anticorpi vengono somministrati ai topi. In genere, eseguiamo l'imaging 24 ore dopo la somministrazione delle cellule T trasdotte dalla luciferasi.
- Preparazione della D-luciferina
- Sciogliere 1 g di D-luciferina in 33,3 mL di PBS sterile (concentrazione finale: 30 mg/mL).
- Aliquotare la D-luciferina disciolta in 33 provette per microcentrifuga da 1,5 mL e mantenere le provette a -20 °C.
- Il giorno dell'imaging, scongelare una quantità sufficiente di aliquote di 30 mg/mL di D-luciferina per il numero di animali da sottoporre a ripresa. Un tubo è sufficiente per 10 animali.
NOTA: Ricongelare la D-luciferina rimanente dopo l'uso. La D-luciferina è stabile per almeno cinque cicli di congelamento/disgelo.
- Somministrazione di D-luciferina a topi
nota: Prima di somministrare la D-luciferina ai topi, aprire il software di imaging e inizializzare il sistema. La fotocamera può impiegare diversi minuti per raffreddarsi e questo dovrebbe essere fatto prima che i topi vengano iniettati con D-luciferina per garantire che l'imaging possa avvenire 5 minuti dopo la somministrazione del substrato.
- Anestetizzare fino a cinque topi in una camera che fornisce il 3,5% (v/v) di isoflurano inalato in 1 L/min di ossigeno. I topi vengono completamente anestetizzati quando il riflesso di ritiro del pedale dell'arto posteriore è scomparso.
- Una volta che i topi sono completamente anestetizzati, somministrare 100 μL di 30 mg/mL di D-luciferina per topo (3 mg per topo) mediante iniezione retroorbitale con un ago da 26 G. Immagina questo gruppo di topi prima di somministrare la D-luciferina al gruppo successivo. Posizionare il gruppo successivo di topi nella camera dell'isoflurano da anestetizzare mentre il gruppo precedente viene visualizzato.
- Imaging delle cellule T trasdotte dalla luciferasi
- Spostare i topi anestetizzati nella camera a tenuta di luce della termocamera e continuare a somministrare isoflurano al 3% a 0,5 L/min. Posizionare i topi su un fianco in modo che il fianco che porta lo xenotrapianto sia rivolto verso la telecamera. Scatta un'altra serie di immagini con i topi in posizione supina per valutare la presenza di cellule T nei polmoni.
- Utilizzando il Pannello di controllo Acquisizione, selezionare Luminescente, Fotografia e Sovrapposizione. Impostare il tempo di esposizione su auto, il binning su medio e F/Stop su 1. Acquisisci immagini. Dopo la prima immagine, impostare il tempo di esposizione in modo che corrisponda a quello calcolato automaticamente per la prima immagine in modo che le immagini successive possano essere confrontate direttamente. Può essere utile acquisire immagini con tempi di esposizione multipli per determinare il tempo di esposizione ottimale per ottenere il segnale più luminoso senza saturazione dei pixel.
- Togliete i topi dall'isoflurano, tornate nelle loro gabbie e osservate fino a quando non sono svegli e deambulanti.
- Ripetere i passaggi dal passaggio 4.2.1 fino a quando non sono stati ripresi tutti i gruppi.
