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1. Colture cellulari e di parassiti
- Coltivare le cellule LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) dell'American Type Culture Collection (CCL-7) in un pallone di coltura cellulare da 25 cm2 contenente nel terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) integrato con il 10% di FBS (siero fetale bovino) inattivato a caldo e antibiotici (100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina) a 37 °C in anidride carbonica (CO2) al 5%.
- Infettare le cellule LLC-MK2 con Trypanosoma cruzi (ceppo Y) secondo un protocollo precedente.
- Raccogliere il surnatante delle cellule infette da LLC-MK2 (5 mL) in una provetta da centrifuga conica per colture cellulari da 15 mL e centrifugare a 500 x g per 10 minuti e 22 °C per ridurre i detriti cellulari. Tenere il tubo per 10 minuti a 37 °C per consentire ai tripomastigoti di nuotare verso il surnatante.
- Raccogliere il surnatante in una nuova provetta conica e centrifugare a 2500 x g per 15 minuti a 22 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet contenente i parassiti in un mezzo RPMI completo per determinare la densità cellulare contando le cellule in una camera Neubauer.
2. Protocollo di controllo dell'immunofluorescenza
NOTA: Una volta fissate, è possibile conservare piastre contenenti vetrini coprioggetti a 4 °C in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (pH 7.2) per una settimana. Per essere conservate, è importante che le cellule non abbiano attraversato la fase di permeabilizzazione.
- Depositare le cellule LLC-MK2 (2 x 104) in piastre a 24 pozzetti contenenti vetrini coprioggetti arrotondati sterilizzati con raggi ultravioletti (UV) in terreni RPMI per 16 ore.
- Per le cellule infette, aggiungere un surnatante contenente T. cruzi (elemento 1.4) a ciascun pozzetto in proporzione (molteplicità dell'infezione, MOI 10:1) e lasciare agire per 6 ore di infezione. Lavare cinque volte i vetrini coprioggetti contenenti cellule infette e non infette con una soluzione di PBS e fissarli con paraformaldeide al 2% in 1x PBS (pH 7,2) per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Lavare i vetrini coprioggetti tre volte per 5 minuti ciascuno con 1x PBS (pH 7,2).
- Permeabilizzare i vetrini coprioggetti con IGEPAL CA-630 allo 0,2% (ottilfenossipolietossietanolo) in 1x PBS (PH 7,2) per 10 minuti a RT.
- Lavare i vetrini coprioggetti tre volte per 5 minuti ciascuno con 1x PBS.
- Incubare i vetrini coprioggetti per 30 minuti a RT con la soluzione bloccante (albumina sierica bovina al 2%, BSA in 1x PBS, pH 7,2).
- Incubare i vetrini coprioggetti per 30 minuti a RT con anticorpi monoclonali di topo anti-hnRNPA1 (anti-eterogenea ribonucleoproteina-A1) (diluizione 1:200) o con anticorpi policlonali di topo anti-TcFAZ (anti-Trypanosoma cruzi flagellum attachment zone protein) (diluizione 1:100) diluiti in soluzione bloccante.
- Lavare i vetrini coprioggetti tre volte per 5 minuti ciascuno con 1x PBS.
- Incubare i vetrini coprioggetti per 30 minuti a RT con IgG F (ab')2 (H+L) anti-topo di capra coniugata ad Alexa Fluor 488 (1:600) insieme a falloidina coniugata ad Alexa 594 (1:300) per colorare i filamenti di actina (F-actina) nella cellula ospite diluiti nella soluzione bloccante.
- Lavare tre volte con 1x PBS (pH 7,2) per 5 minuti ciascuna.
- Applicare una piccola quantità di reagente di montaggio antisbiadimento ProLong Gold con terreno 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) sulla superficie del vetrino.
- Utilizzando una pinza, inclinare delicatamente il vetrino coprioggetti nel mezzo di montaggio per evitare la formazione di bolle. Una volta asciutto, sigillare il vetrino coprioggetti se lo si desidera.
3. Protocollo di immunofluorescenza a doppia marcatura utilizzando anticorpi monoclonali e policlonali allevati nello stesso ospite
- Ripetere i passaggi da 2.1 a 2.6 descritti sopra.
- Incubare i vetrini coprioggetti contenenti cellule infette e non infette con anticorpo policlonale anti-TcFAZ di topo interno (1:100) diluito in soluzione bloccante per 30 minuti a RT.
- Lavare i vetrini coprioggetti tre volte per 5 minuti ciascuno con 1x PBS.
- Incubare i vetrini coprioggetti per 30 minuti a RT con IgG di capra anti-topo F (ab')2 (H+L) coniugato ad Alexa Fluor 647 (1:600) diluito nella soluzione bloccante.
- Lavare i vetrini coprioggetti tre volte per 5 minuti ciascuno con 1x PBS.
- Eseguire la seconda fase di blocco con AffiniPure rabbit anti-mouse IgG (H+L) diluito (0,12 mg/mL) in soluzione bloccante per 30 minuti a RT.
- Lavare i vetrini coprioggetti tre volte con 1x PBS (pH 7,2) per 5 minuti ciascuno. Quindi incubare con anticorpo monoclonale di topo anti-hnRNP A1 IgG2b (1:200) per 30 minuti a RT.
- Lavare i vetrini coprioggetti tre volte per 5 minuti ciascuno con 1x PBS.
- Incubare i vetrini coprioggetti per 30 minuti con anticorpo IgG2b anti-topo di capra coniugato ad Alexa Fluor 488 (1:600) e con falloidina coniugata ad Alexa 594 (1:300) diluita nella soluzione bloccante.
- Lavare i vetrini coprioggetti tre volte per 5 minuti ciascuno con 1x PBS.
- Ripetere i passaggi da 2.8 a 2.10 descritti sopra.