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1. Purificazione degli anticorpi mediante cromatografia di affinità utilizzando un sistema automatizzato di cromatografia liquida di proteine veloci (FPLC)
NOTA: La seguente procedura può essere generalmente applicata alla maggior parte dei sistemi automatizzati. La purificazione può essere eseguita a temperatura ambiente o a 4 °C (se il sistema FPLC viene conservato in una stanza fresca). È possibile eseguire una serie di test di scouting per identificare le condizioni di purificazione ottimali, tra cui la matrice della colonna appropriata, il tampone di legame, il tampone di eluizione e il pH per garantire il massimo recupero dell'anticorpo purificato dai terreni condizionati (fare riferimento alla sezione Risultati). Le condizioni ottimali dipendono dall'anticorpo o dalla proteina da purificare. Le purificazioni sono state eseguite su un sistema FPLC automatizzato. Le purificazioni sono state eseguite a temperatura ambiente utilizzando una colonna di proteina A da 5 ml.
- Preparare i seguenti tamponi utilizzando acqua ultrapura e regolarli al pH consigliato, quindi filtrare con un filtro da 0,22 μm.
- Preparare 1 L di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7,4 (tampone legante) miscelando i seguenti elementi: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na2HPO4 e 0,001 M KH2PO4. Se necessario, regolare il pH prima di filtrare il tampone.
- Preparare 500 ml di glicina-HCl 0,1 M pH 2,7 (tampone di eluizione). Regolare il pH prima di filtrare il tampone.
- Preparare 50 ml di 1 M Tris pH 9.0 (tampone di neutralizzazione).
- Assicurarsi che tutti i collegamenti di alimentazione e comunicazione del sistema con il computer siano effettuati. I dispositivi devono essere visibili nel modulo software "Controllo del sistema". Assicurarsi che la cella UV sia impostata su una lunghezza d'onda di 280 nm. Opzionale: calibrare il pHmetro se collegato e da utilizzare.
- Immergere i tubi di ingresso di A, B e la pompa del campione in acqua ultrapura per lavare il sistema. Spurgare le pompe con una siringa se c'è aria nel tubo o se si sospetta la presenza di aria nel sistema. Lavare l'impianto con acqua mediante azionamento manuale tramite il controller di sistema o tramite un metodo automatizzato. Osservare che la pressione, la conducibilità, il tracciamento UV280 e il pH rimangano costanti e che il limite di pressione per la colonna non venga superato secondo le specifiche del produttore.
nota: Le anomalie possono indicare aria o ostruzione nel sistema che dovrebbero essere affrontate prima di procedere.
- Nel modulo di controllo del sistema, avviare manualmente la portata a 1 ml/min tramite la pompa A in posizione di carico (bypassando il circuito del campione) o di iniezione (attraverso il circuito del campione) per iniziare a collegare la colonna. Scollegare il tubo del sistema dall'ingresso della colonna e rimuovere il tappo collegato all'ingresso della colonna.
- Lasciare che l'acqua scorra dal tubo del sistema in senso gocciolante sulla parte superiore della colonna, quindi collegare il tubo del sistema alla colonna. Avere l'ingresso della colonna e il raccordo di ingresso traboccanti di gocce d'acqua garantisce un collegamento privo di bolle d'aria.
- Collegare l'uscita della colonna all'uscita a valle e verificare che tutti i raccordi siano ben fissati. Con la colonna ora collegata al sistema, non superare i limiti di pressione massima e la portata come indicato nelle specifiche della colonna.
- Colonna di lavaggio con 5 volumi di colonna (CV) di acqua. Se necessario, continuare il lavaggio della colonna fino a quando il tracciato UV280 non si è stabilizzato.
- Immergere le provette di ingresso di A nel tampone di legame, B nel tampone di eluizione e la pompa del campione nel tampone di legatura per bilanciare il sistema nei tamponi corretti. Riempire i tubi di ingresso con il tampone utilizzando PumpWash con l'operazione manuale.
- Nel modulo 'Editor dei metodi' del software, utilizzare la procedura guidata per impostare un metodo di cromatografia di affinità per la colonna che si intende utilizzare.
nota: I sistemi FPLC automatizzati sono dotati di metodi precompilati con le impostazioni consigliate (ad es. portata e limite di pressione) e fasi di esecuzione in base alla colonna (produttore, matrice e dimensione) selezionata per la purificazione.
- Utilizzare i seguenti passaggi di esecuzione per la cromatografia di affinità della proteina A:
- Equilibrare il sistema con 5 CV di tampone legante e raccogliere il flusso nel contenitore dei rifiuti.
- Caricare il campione sulla colonna (il volume da caricare viene specificato manualmente nel metodo) e raccogliere il flusso in un contenitore separato.
- Sistema di lavaggio con 5 CV di tampone di legatura e raccolta del flusso in un contenitore separato.
- Eluire la colonna con frazionamento isocratico a 5 CV utilizzando il tampone di eluizione e raccogliere il campione di anticorpi purificati come frazioni mediante collettore di frazioni.
- Equilibrare il sistema con 5 CV di tampone legante e raccogliere il flusso nel contenitore dei rifiuti.
- Una volta impostato il metodo, specificare il volume dei supporti condizionati da applicare alla colonna e salvare il metodo.
nota: Il volume specificato nel metodo deve essere inferiore di 5-10 ml rispetto al volume effettivo per evitare l'introduzione di aria durante l'esecuzione del campione. Il volume specificato utilizzato in questo protocollo è 90-120 ml.
- Immergere il tubo della pompa del campione nel recipiente contenente il fluido condizionato.
- Preparare un contenitore separato per raccogliere il flusso del campione attraverso il tubo di uscita specificato.
nota: È importante raccogliere il flusso nel caso in cui si verifichi un errore durante la corsa o la capacità di legatura della colonna venga superata, richiedendo la riapplicazione del flusso alla colonna o la ripetizione della purificazione.
- Preparare le provette di raccolta nel raccoglitore di frazioni. Aggiungere 100 μl di tampone di neutralizzazione per 1 ml di volume di frazione. Il sistema FPLC eluirà automaticamente le frazioni nelle provette di raccolta.
- Nel modulo 'Controllo di sistema' del software, aprire il metodo da eseguire.
nota: L'esecuzione del metodo viene avviata in una serie di pagine che includono il controllo delle variabili del metodo, l'impostazione del raccoglitore di frazioni e la definizione del nome del file dei risultati e della posizione di archiviazione.
- Fare clic su AVVIA per avviare l'esecuzione. La corsa può essere monitorata nel modulo "Controllo del sistema".
- Al termine del ciclo di purificazione, controllare il cromatogramma risultante nel modulo "Valutazione" del software di sistema.
- Combinare tutte le frazioni contenenti proteine in una provetta separata, scambiare il tampone e concentrarlo in PBS utilizzando un dispositivo di filtraggio centrifugo con peso molecolare tagliato a 30 kDa. Eseguire le fasi di centrifugazione secondo le istruzioni del produttore.
- Misurare la concentrazione di anticorpi utilizzando il dosaggio dell'acido bicinchoninico (BCA) secondo le istruzioni del produttore.
- Se è necessario eseguire un'altra operazione di purificazione, adescare il tubo della pompa del campione nel tampone di legame e ripetere i passaggi 1.9-1.14.
- Al termine delle operazioni di purificazione, immergere i tubi di ingresso di A, B e la pompa del campione in acqua ultrapura e lavare il sistema e la colonna come eseguito nella fase 3.
- Immergere i tubi A, B e della pompa di campionamento in etanolo al 20% e ripetere la procedura di lavaggio per lo stoccaggio del sistema e della colonna.
- Scollegare la colonna dall'uscita a valle e sostituire il tappo della colonna, quindi scollegare la colonna all'ingresso e sostituire il tappo, ricollegare i tubi al sistema. Conservare la colonna a 4 °C.